Anti-neuroinflammatory Effects of Quercetin-3-O-glucuronide Isolated from the Leaf of Vitis labruscana on LPS-induced Neuroinflammation in BV2 Cells

포도잎으로부터 분리된 Quercetin-3-O-glucuronide의 LPS로 유도된 BV2 미세아교세포에서의 항염증 효과

Abstract

Grapes has long been used for food, and reported as containing polyphenol which has antioxidant and anti-cancer effects. Neuroinflammation is chronic inflammation at the brain, lead to neurodegenerative diseases. In this study, quercetin-3-O-glucuronide (QG) isolated from the leaf of Vitis labruscana has anti-neuroinflammatory effects. QG were investigated using MTT assay, western blot, nitric oxide (NO) assay, prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) assay, cytokine assay in lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation in BV2 cells. QG dose-dependently attenuated the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2), accordingly inhibited the production of NO and $PGE_2$. QG decreases the levels of proinflammatory cytokine such as tumor necrosis factor-${\alpha}$ (TNF-${\alpha}$), interlukin-$1{\beta}$ (IL-$1{\beta}$). Thereby, QG may offer therapeutic potential for treatment of neurodegenerative disease related to neuroinflammation.

재료 및 방법

실험재료 − 본 실험에 사용된 포도잎은 2013년 전북 김제시 백구면 지역의 포도 재배 농가에서 재배된 것을 채취 후 건조하여 사용하였으며, 원광대학교 자원식물원 장규관 교수에게 의뢰하여 동정하였다. 확증표본(WP-2013-76)은 원광대학교 약학대학 표본실에 보관하였다. 정선된 포도잎(Vitis labruscana B. campbell early) 100 g을 20배의 50% 에탄올과 3% 초산(acetic acid)을 넣고, 85~95℃에서 3시간 동안 추출하였다. 추출액을 1 μm 크기의 마이크로필터를 이용하여 여과하고 잔사를 동일 조건으로 2회 추출하고 여과 후 60℃이하에서 감압농축하여 건조엑스 약 21.4 g을 얻었다(수득률 21.4%).

시약 및 기기 − DMEM 배지, trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), fetal bovine serum (FBS)는 Gibco Laboratorie사에서 구입하였다. L-glutamate, Trolox와 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma사에서 구입하였다. 96-Well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader 를 이용하여 측정하였다. NMR 스펙트럼은 JEOL JNM ECP-400 spectrometer(400 MHz for 1H and 100 MHz for 13C)기기로 DMSO-d6와 CD3OD 용매를 이용하여 측정하였다. HPLC는 Younglin사의 YOUNGLIN-YL9100 기기를 통하여 측정하였고, column은 SHISHIDO사의 CAPCELL PAK C18 (4.6 mmI.D×250 mm, 5 μm-particle size)를 이용하였다.

포도 잎 추출물로부터 QG의 분리 및 NMR Analysis − 포도잎 추출물 14 g을 증류수로 현탁 시킨 후 n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, BuOH 순으로 분획한 후 각 분획들을 감압 농축하여 용매를 휘발시킨 뒤 무게를 측정하였다. n-hexane (1.1 g), CH2Cl2 (0.7 g), EtOAc (0.9 g), BuOH (2.1 g), H2O (9.3 g)을 얻었고, BuOH 분획물 2.1 g을 Sephadex-LH20 column chromatography를 이용하여 80%와 100% MeOH의 용매 조건으로 순차적인 분획을 나누어 4가지 분획물을 얻고 감압 농축하였다. 3번째 분획물 0.27 g을 두 차례 reverse phase (RP-C18) column chromatography를 50% MeOH의 용매 조건으로 하여 quercetin-3-O-glucuronide (41 mg)을 얻었다.

Quercetin-3-O-glucuronide: 1H NMR data (400 MHz, CD3OD) δ 7.70 (1H, s, H-2'), 7.59 (1H, dd, J=2.0 Hz, 8.4 Hz, H-6'), 6.83 (1H, d, J=8.4 Hz, H-5'), 6.36 (1H, brs, H-8), 6.18 (1H, d, J=1.5 Hz, H-6), 5.31 (1H, d, J=7.3 Hz, H-1"), 3.74 (1H, d, J=9.0 Hz, H-5"), 3.61-3.43(3H, combine glucose peak, H-2",3",4"); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 177.2 (s, C-4), 170.0 (s, C-6"), 164.2 (s, C-7), 161.1 (s, C-5), 156.5 (s, C-2), 156.2 (s, C-9), 148.4 (s, C-4'), 144.8 (s, C-3'), 133.2 (s, C-3), 121.3 (s, C-6'), 120.7 (s, C-1'), 116.5 (s, C-5'), 115.2 (s, C-2'), 103.8 (s, C-10), 101.6 (s, C-1"), 98.7 (s, C-6), 94.2 (s, C-8), 76.0 (s, C-3"), 75.5 (s, C-2"), 73.8 (s, C-5"), 71.3 (s, C-4").

검량선 작성 − QG를 250 mg/ml, 125 mg/ml, 62.5 mg/ml, 31.25 mg/ml, 15.625 mg/ml의 농도로 조제하였다. HPLC 측정 시 QG는 각각 10 μl씩 주입하였고, 5%-50%-100%(v/v) AcN을 용매기울기법으로 측정하였다. 이를 이용하여 외부 검량선을 얻었으며 검량선의 식은 Y=33.7X+400.2(R2=0.9965)이다. 여기서 Y는 HPLC를 UV/vis 330 nm에서 분석한 peak area이며, X는 QG의 양을 의미한다. 얻어진 검량선을 이용하여 포도 잎 추출물에서의 QG의 농도를 구한 후, 함량을 %(w/w)로 환산하였다.

세포 배양 − BV2 미세아교세포(5×105 cells/well)를 10% heat-inactivated FBS, penicillin G (100 IU/ml), streptomycin (100 μg/ml), L-glutamine (2 mM)을 함유한 DMEM 배지에 분주하고 5% CO2 배양기 내에서 37°C의 온도로 배양하였다.

세포 독성 −본 실험에서 BV2 미세아교세포에 대한 세포 독성 및 실험 시 처리 농도를 결정하고, QG의 세포독성을 측정하기 위해 MTT assay를 사용하였다. 간단히 기술하면 먼저 96 well plate에 1×104 cells/well로 동일하게 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 기존의 배지를 제거하고 새로운 배지를 넣어준 후 DMSO에 녹인 시료를 다양한 농도(10, 20, 40, 80 μM)로 DMEM 배지에 희석하여 첨가하였다. DMSO의 처리 농도는 배지 대비 0.1% 이하가 되도록 하였다. 이를 다시 24시간 배양한 후에 배지를 제거하고 MTT 시약(5 mg/ml)을 넣고, 4시간 동안 방치한 후 상등액을 제거하였다. 형성된 formazan의 각 well에 DMSO 20 μl를 첨가한 후 orbital shaker를 이용하여 녹이고, 30분 후 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 3회 반복 실시하여 평균 값을 구하였으며, control의 흡광도 값을 기준으로 세포 생존율을 비교하였다.

Western Blot Analysis − BV2 세포를 60 mm dish에 3×105 cells/well 밀도로 24시간 배양한 후 각각의 시료를 농도별로 처리하였다. BV2 세포에 RIPA buffer를 첨가한 다음, 4℃, 14,000×g에서 25분간 원심분리하고 상등액을 튜브에 옮겼다. 단백질 정량은 BSA 단백질 실험 키트를 이용하였고 각각의 시료를 12% SDS-polyacrylamide gel에서 영동하고 nitrocellulose membrane(NC membrane)으로 전사하였다. 전사된 NC membrane을 5% 무지방유가 포함된 신선한 blocking buffer(0.1% Tween 20 in Tris-buggered saline)에서 blocking한 후 iNOS, COX-2 antibody를 1:1000으로 희석하여 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 다시 2차 antiboby (Anti-mouse IgG)를 1:1000으로 희석하여 넣고 1시간 동안 반응한 다음, ECL 용액을 1:1로 잘 섞어서 NC membrane 위에 가하여 발광시키고 암실에서 X선 필름에 감광한 후 현상하였다. 같은 방법으로 actin antibody를 이용하여 actin을 측정한다.

Nitrite Assay −배양된 세포를 5×105 cells/well 수준으로 96 well plate에 100 μl 씩 접종한 다음 24시간 동안 배양하고, 24시간 후 medium을 제거한 후 DMEM으로 희석된 각 농도별 시료 처리 후 LPS(1 μg/ml)를 처리하여 24시간 후 세포에서 media로 분비되어 나온 NO의 양을 Griess시약 (0.1%(w/v) N-(1-naphathyl)-ethylenediamine and 1%(w/v) sulfanilamide in 5%(v/v) phosphoric acid)을 사용하여 반응하였다. 반응 후 ELISA micro plate reader(Bio Rad Laboratories Inc., California, USA, Model 550)를 사용하여 540 nm에서 측정하였다.

EIA에 의한 PGE2 측정 − PGE2의 측정은 항체(lyophilized prostaglandin E2 conjugate to horseradish peroxidase)를 사용하여 prostglandin E2 enzymeimmunoassay system(EIA, Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ)을 이용하였다.

TNF-α and IL-1β assay − TNF-α와 IL-1β의 측정은 항체(lyophilized TNF-α or IL-1β conjugate to horseradish peroxidase)를 사용하여 enzymeimmunoassay system kit (R&D Systems, Abingdon, UK)을 이용하여 측정 하였다.

통계처리 − 본실험의 통계처리는 GraphPad Prism, version 3.03(GraphPad Software Inc., San Diego, CA)을 사용하였다. 각 실험군 간의 결과는 평균치와 표준오차로 나타내었으며, 각 실험군 간의 결과는 ANOVA test를 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다. 실험군 간의 차이는 95% 수준(p<0.05)에서 유의성 있는 것으로 하였다.

 

결과 및 고찰

염증 반응이란 외부 자극이나 질병에 대하여 다양한 세포와 여러 인자들이 관여하는 일련의 방어 기전이다. 염증이 발생하면 염증 부위에 면역 세포들이 침투되고, 화학반응에 의해 사이토카인이나 여러 인자들이 생성 및 분비된다. 염증 초기에 항원제공 및 탐식에 관여하는 대식세포는 NO, TNF-α 등을 분비하여 염증 반응을 일으켜 생체를 방어한다. 하지만 과도한 염증반응은 세포 손상 등의 병리적 상태에 이르게 하기 때문에 염증 반응을 유발하는 사이토카인 이나 염증 매개체의 조절하는 것이 염증성 질환의 치료법으로 제시되고 있다.22,23) 뇌염증은 신경병성 장애로 인한 신경 조직의 병리적인 상태이다.24,25) BV2 세포는 무한증식하는 murine 세포로 소교세포의 병리 작용에 관한 실험에 널리 쓰이고 있다. 미세아교세포는 신경교의 대식 세포로 중추신경계의 10-20% 정도를 차지하며, 면역 방어나 조직 재생의 중요한 역할을 한다.26,27)

본 연구에서는 선행연구를 통해 포도잎 추출물이 LPS로 자극한 BV2 세포에서 NO의 생성을 억제하는 효과가 있음을 확인하였고, 이 결과를 바탕으로 추출물 14 g을 분획하여 얻은 n-Hexane, CH2Cl2, EtOAc, BuOH 분획물을 BV2 세포에서 NO assay 결과 BuOH 분획물에서 NO 억제 효과를 나타내어 BuOH 분획물의 분리를 진행하였다. BuOH 분획물 2.1g을 Sephadex LH-20 column chromatography, reverse phase(RP-18) column chromatography 이용하여 순수한 화합물 quercetin-3-O-glucuronide을 얻었고, QG의 1H NMR과 13C NMR을 측정한 후 선행 문헌28,29)과의 비교를 통해 구조를 동정하였다(Fig. 1A). QG를 이용한 포도잎 추출물의 HPLC 정량실험에서 추출물에 QG가 0.74% 함유되어 있음을 확인하였다. 포도잎으로부터 분리한 QG가 미세아교세포에서 항염증 효과를 갖는지 검색하기 위해, LPS로 유도된 BV2 미세아교세포에서의 염증 관련 인자들을 측정하였다. QG의 BV2 세포에서의 독성은 MTT assay를 통해 확인하였고, QG를 농도별로 BV2 미세아교세포에 처리 하였을 때, 세포 독성을 나타내지 않은 10, 20, 40, 80 μM을 실험 가능한 농도로 정하여 실험을 진행하였다(Fig. 1B). 항염증 효과를 검색하기 위해서 LPS로 유도한 BV2 세포에서 iNOS, COX-2 단백질의 발현과 이에 따라 나오는 부산물인 NO, PGE2의 생성을 측정하였다. 먼저 BV2 미세아교세포에 QG를 10, 20, 40, 80 μM로 3시간 동안 전 처리한 후, LPS 1 μg/ml을 처리하고 24시간 후에 iNOS와 COX-2의 발현 정도를 Western blot을 통해 관찰하였다. QG는 농도 의존적으로 iNOS와 COX-2의 발현을 감소시켰다(Fig. 2). 다음으로, BV2 미세아교세포에 QG를 10, 20, 40, 80 μM로 처리한 후, 3시간 동안 incubator에 배양하고 LPS 1 μg/ml을 처리하였고, 24시간 후에 NO와 PGE2의 생성을 확인하였다. QG는 농도 의존적으로 NO와 PGE2의 생성 또한 감소시켰다(Fig. 3). 다음으로는 BV2 미세아교세포에 QG를 10, 20, 40, 80 μM로 처리한 후, 3시간 동안 incubator에 배양하고 LPS 1 μg/ml을 처리하여, 염증 반응에서 생성되는 사이토카인 TNF-α, IL-1β들을 측정하였다. QG는 LPS로 유도된 BV2 세포에서 사이토카인을 농도 의존적으로 감소시켰다(Fig. 4). 한편, QG는 human macrophage에서도 항염증 효과를 나타낸다는 사실이 보고되어 있어,12) QG가 본 연구에서 사용한 BV2에서 항염증 효과를 나타내는 것을 보완해주는 결과라고 판단된다.

Fig. 1.Chemical structure of QG (A) and effects of QG on cell viability (B). BV2 microglia were incubated for 24 h with various concentrations of QG (10-80 μM). Cell viability was determined as described under Materials and methods. Data represent the mean values of three experiments ±SD.

Fig. 2.Effects of QG on protein iNOS (A) and COX-2 (B) expression in BV2 microglia stimulated with LPS. Cells were pretreated for 3 h with indicated concentrations of QG, and 24 h with LPS (1 μg/mL). Western blot analysis (A, B) were performed as described in Materials and methods, and representative blots of three independent experiments are shown. *p<0.05 compared to the group treated with LPS. **p<0.05 compared to the group treated with compound.

Fig. 3.Effects of QG on nitrite (A), PGE2 (B) production in BV2 microglia stimulated with LPS. Cells were pre-treated for 3 h with indicated concentrations of QG, and stimulated 24 h with LPS (1 μg/mL). The concentration of nitrite (A), PGE2 were determined as described under Materials and methods. Data represent the mean values of three experiments ±SD. *p<0.05 compared to the group treated with LPS. **p<0.05 compared to the group treated with compound.

Fig. 4.Effects of QG on TNF-α (A), and IL-1β (B) production in BV2 microglia stimulated with LPS. Cells were pre-treated for 3 h with indicated concentrations of QG, and stimulated 24 h with LPS (1 μg/mL). The concentration of TNF-α (A), and IL-1β (B) were determined as described under Materials and methods. Data represent the mean values of three experiments ±SD. *p<0.05 compared to the group treated with LPS. **p<0.05 compared to the group treated with compound.

 

결 론

본 연구에서는 포도잎 추출물에서 분리한 QG의 항염증 효과를 확인하고자 하였고, 그 결과 QG는 유의적인 항염증효과를 나타냈다. QG는 iNOS와 COX-2의 발현 억제와, 그의 부산물인 NO, PGE2의 생성을 억제시켰고, TNF-α, IL-1β와 같은 사이토카인의 생성을 억제하는 뚜렷한 항염증 효과를 나타냈다. 이러한 결과와 선행 연구들을 토대로 포도잎과 그 주요 성분인 QG는 앞으로 퇴행성 뇌질환 약물이나 항염증제로 개발 가능할 것으로 사료된다.