In Vitro Anti-bacterial and Anti-inflammatory Effects of Six Types of Herb Aqueous Extracts

일부 살충해독유(殺蟲解毒類) 한약의 Staphylococcus aureus에 대한 시험관 내 항균 및 항염 효과

Abstract

Objectives: The object of this study was to observe the in vitro anti-bacterial and anti-inflammatory effects of six single aqueous herbal extracts-Quisqualis Fructus (QuF), Meliae Cortex (MeC), Arecae Semen (ArS), Crassirhizomae Rhizoma (CrR), Ulmi Pasta Semen(UlS), Torreyae Semen(ToS)- against Staphylococcus aureus (S. aureus) and Lipopolysaccharide(LPS)-activated Raw 264.7 cells. Methods: Anti-bacterial activities against S. aureus of aqueous extracts of QuF, MeC, ArS, CrR, UlS and ToS were detected using standard agar microdilution methods. In addition, the effects on the cell viability, prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$), nitric oxide (NO), tumor necrosis factor-${\alpha}$ (TNF-${\alpha}$), interleukin (IL)-$1{\beta}$ and IL-6 productions of LPS activated Raw 264.7 cells were detected. The anti-bacterial and anti-inflammatory effects were respectively compared with lincomycin and piroxicam. Results: Minimal Inhibition Concentration (MIC) of aqueous extracts of QuF, MeC, ArS, CrR, UlS and ToS against S. aureus was respectively detected $5.625{\pm}4.075$ (3.125~12.500), $0.332{\pm}0.273$ (0.098~0.782), $1.094{\pm}0.428$ (0.782~1.563), $2.969{\pm}2.096$ (0.782~6.250), $9.375{\pm}4.419$ (3.125~12.500)>25 mg/ml. MIC of lincomycin was detected as $0.469{\pm}0.297$ (0.195~0.782) ${\mu}g/ml$ at same conditions. In addition, $ED_{50}$ against LPS-induced cell viabilities and cytokine releases of QuF, MeC, ArS, CrR, UlS and ToS was as follows - Cell viability: 66.370, 2.908, 1.747, 259.553, 18.150 and 34.160 mg/ml; NO production: 389.486, 0.294, 0.138, 523.060, 45.363 and 49.327 mg/ml; $PGE_2$ production: 114.271, 0.223, 0.046, 243.078, 8.829 and 28.947 mg/ml; TNF-${\alpha}$ production: 406.288, 0.343, 0.123, 9404.227, 125.406 and 140.775 mg/ml; IL-$1{\beta}$ production: 117.178, 0.135, 0.019, 237.451, 7.923 and 19.418 mg/ml; IL-6 production: 31.261, 0.105, 0.055, 128.434, 2.290 and 3.745 mg/ml. ED50 of piroxicam against LPS-induced cell viabilities, NO, $PGE_2$, TNF-${\alpha}$, IL-$1{\beta}$ and IL-6 were detected as 35.179, 6.552, 1.162, 7.273, 7.101 and $5.044{\mu}g/ml$, respectively at same conditions. Conclusions: All six single aqueous herbal extracts showed anti-bacterial effects against S. aureus, in the order of MeC, ArS, CrR, QuF and UlS aqueous extracts except for ToS; they did not showed any anti-bacterial effects (MIC>25 mg/ml). They also showed anti-inflammatory effects against LPS-activated Raw 264.7 cells in the order of ArS, MeC, UlS, ToS, QuF and CrR aqueous extracts. It means that the ArS and MeC will be showed favorable potent anti-bacterial and related anti-inflammatory effects.

I. 서 론

유방염은 젖이 나오는 관의 구멍 또는 도중의 어느 곳이 막혀서 젖이 고이기 때문에 생기며, 오래 경과하여 세균 감염이 발생하면 급성 화농성 유방염으로 진행한다1). 화농성 유방염의 주된 원인균은 Staphylococcus aureus(S. aureus)로 대부분 유아의 코나 상기도에 서식하던 Staphylococci가 유두의 열구 혹은 찰과 부위로 들어가서 발생한다2). 치료를 위하여 β-lactam계를 비롯한 다양한 항생제가 사용되어 왔지만 내성을 가진 균들이 나타나기 시작하였고, 이를 보완하기 위해 개발된 다른 항균제에도 내성균이 증가하고 있기 때문에 항생제의 사용을 줄이면서 효과가 우수한 대체 약물 혹은 천연물 유래의 치료제 개발이 시급한 실정이다2-5).

한의학에서는 유방의 紅腫熱痛과 전신의 惡寒發熱 증상을 수반하는 유선조직의 화농성 질환을 乳癰이라고 하는데, 未潰와 已潰를 구분해서 치료하며, 鬱瘀期에는 肝鬱胃熱, 熱毒內盛을 변별하여 瓜蔞牛蒡湯, 加味芷貝散, 托裏消毒飮, 仙方活命飮과 같은 처방을 사용한다6). 지금까지 유방염에 대한 실험 연구로는 乳癰에 다용되어 사용된 加味芷貝散7), 透膿散과 瓜蔞牛蒡湯에 대한 연구8)가 있었으며, 白頭翁, 敗醬草, 地楡, 槐花, 苦蔘과 같은 淸熱, 凉血 작용이 있는 단미제를 사용한 연구9)가 있었으나, 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑, 榧子에 대한 연구는 아직 접하지 못하였다. 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑, 榧子는 殺蟲解毒劑에 속하는 약재로, 지금까지 이들의 항균 및 항염 효과가 입증되어 왔으므로 유방염의 원인균인 S. aureus에 대하여 유효한 항균 효과를 나타낼 것으로 생각 되어 본 연구를 계획하였다.

본 연구에서는 S. aureus를 이용하여 표준 액체배지 희석법10)으로 최소 저지농도(Minimal Inhibition Concentration(MIC))를 측정하여 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 물 추출물의 항균력을 평가하였으며, 각각의 물 추출물의 항균력은 lincomycin과 비교하였다. 또한 항염 및 염증 관련 cytokine의 발현에 대한 연구를 수행하기 위하여 LPS로 활성화된 murine macrophage 세포주인Raw 264.7 세포를 이용하여 세포 생존율, prostaglandin E2(PGE2), nitric oxide(NO), tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin(IL)-1β 및 IL-6 분비에 미치 는 영향을 각각 평가하였으며, 각각의 물 추출물의 항염 효과는 piroxicam과 비교하였다. 이에 저자는 S. aureus에 대한 이 여섯 가지 약재의 항균 및 항염효과에 대한 분석을 통하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

 

II. 재료 및 방법

使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子는 제천한방약초(제천, 한국)에서 매입한 것을 현미경 하에서 관능 검사를 통하여 선정하여 사용하였으며, 배지 및 시약으로 사용된 Brain-heart Infusion(BHI), Muller Hinton agar(MH) agar 또는 broth, Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)은 Difco(MI, USA)에서 각각 구입하였고, methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT), Lipopolysaccharide(LPS) (from Escherichia coli 0111:B4), 대조 약물인 lincomycin hydrochloride 및 piroxicam은 Aldrich-Sigma(MO, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 또한 96 well-plate는 Greiner(Germany)에서 구입하였으며, PGE2, TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 ELISA Kit는 Pierce endogen(Rockford, IL, USA)에서 구입하여 사용하였고, 이외 시약은 Aldrich-Sigma(MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

1. 시료(물 추출물)의 준비

본 실험에 사용된 모든 약재 각 100ｇ을 취하여, 정제수 1000 ml로 80℃에서 3시간 동안 3번 가열 추출한 후, 흡인여과한 여과액을 rotary vacuum evaporator(Buchi Rotavapor R144, Buchi Labortechnik AG, Switzland)로 감압, 농축하여 각각 점조성의 추출물을 얻은 다음 programmable freeze dryer(Labconco Freezone1, Labconco Corp. MO, USA)를 사용하여 동결 건조시켜 갈색, 적갈색 또는 연갈색의 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 물 추출물을 각각 수율 15.32%, 18.95%, 17.29%, 13.16%, 17.22% 및 15.06%을 얻어 실험에 사용하였으며, 각각의 특성은 table 1과 같다. 준비한 각각의 동결 건조 추출물은 -20℃의 냉장고에 보관 후 실험에 사용하였으며, 구입한 lincomycin 및 piroxicam은 4℃의 냉장고에 보관한 후 사용하였다. 모든 동결 건조 추출물은 사용한 용매인 증류수에 25 mg/ml의 농도까지 용해되었고, lincomycin 및 piroxicam은 25 및 100 μg/ml까지 용해되었다.

Table 1.Characteristics of Individual Herbal Extracts Used in This Study

2. 균주, 세포주 및 배지

S. aureus는 American Type Culture Collection Center(VA, USA)에서 동결건조 상태로 구입하여 BHI 배지에 녹인 후 BHI agar에 2~3회 계대 배양한 후 사용하였으며, MH agar 또는 broth에서 유지시켰다. 또한 murine macrophage 세포주인 Raw 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, 한국)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 Raw 264.7 세포는 DMEM에 10% FBS, 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 실험 과정의 모든 세포는 80~90%의 onfluence에서실험하였고, 20 passages를 넘기지 않은 세포만 사용하였다.

3. 생균 수의 측정

비교적 정확한 흡광도(OD)와 세균 수의 상관관계를 알아보기 위하여 정량 평판 법을 이용하여 균 수를 측정하였다12,13).S. aureus를 pectrophotometer(Milton Roy Spectronic 20D; Milton Roy Company, PA, USA)를 이용하여 600 nm(OD600)에서의 흡광도를 0.5 cfarland standard와 같은 탁도로 조정한 다음, 균액을 10, 100, 1000 및 10000배로 단계 희석하여 균의 농도가 1×104 CFU/ml이 되도록 만들어 MH agar에 접종하여 37℃, 10% CO2 조건에서 24시간 배양한 다음, 조직 배양 접시에 형성된 집락 수를 희석된 순서대로 OD와 비교하였다. 0.5 Mcfarland standard 탁도는 1.175% barium chloride dihydrate(BaCl2·2H2O) 0.05 ml과 1% sulfuric acid(H2SO4) 9.95 ml을 혼합하여 준비하였다11).

4. 항균 활성도 측정

使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 추출물의 S. aureus에 대한 MIC를 표준 액체배지 희석법10)을 이용하여 측정하였다. 즉 각각의 물 추출물을 25 mg/ml의 농도로 멸균 증류수에 용해시킨 다음 계단식으로 배수 희석하여 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.563, 0.782, 0.391, 0.195, 0.098 및 0 mg/ml의 총 10가지 농도를 준비하고, 각각 멸균된 96 well plate에 100 μl씩 분주하였다. 여기에 S. aureus의 단일 집락 을 MH broth 배지에 접종한 지 48시간 후 OD600을 spectrophotometer로 측정하여 1.5×106 cell이 들어가도록 준비한 cell suspension 100 μl를 분주하였다. 이후 37℃에서 48시간 배양하였다. Lincomycin 역시 25 μg/ml의 농도로 멸균 증류수에 용해시킨 다음 계단식으로 배수 희석하여 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.563, 0.782, 0.391, 0.195, 0.098 및 0 μg/ml의 총 10가지 농도를 준비하고, 동일한 방법으로 bacteria suspension(1.5×106 CFU/ml)을 첨가한 다음 48시간동안 37℃에 배양하였다. MIC는 각각의 growth control well과 시료가 함유된 well의 S. aureus의 성장을 육안적으로 비교 관찰하여 균의 생장 억제가 나타나는 최소 농도로 결정하였다. 모든 실험은 5회 반복하였다.

5. 세포 생존율 측정

Raw 264.7 cell을 96 well plate에 5×104cells/well로 분주한 다음 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 추출물을 각각 농도 별로 처치하여 세포의 생존율을 구하였다. 즉 각각의 물 추출물을 10 mg/ml의 농도로 멸균 증류수에 용해시킨 다음 계단식으로 배수 희석하여 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 및 0 mg/ml의 총 6가지 농도를 준비하고, piroxicam 역시 100, 10, 5, 2.5, 1.25 및 0 μg/ml 농도의 총 6가지 농도를 준비하여, 각각 세포에 처리한 후에 37℃, 5% CO2의 환경이 유지되는 배양기에서 배양하였다. 각각의 물 추출물 처리 1시간 후, 1 μg/ml 농도의 LPS를 다시 첨가한 다음 37℃, 5% CO2 하에서 24시간 배양한 후, 생존 세포에 0.1 mg/ml 농도의 MTT 용액 50 μl를 첨가하고 4시간 배양한 후, 배지를 제거하고 생성된 formazan crystals을 DMSO에 녹여 Automatic ELISA microplate reader(Huntsville, AL, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 무처리 대조군에 대한 ratio로 세포 생존율을 측정하였으며, 5회 반복 실험을 거쳐 산출된 평균 수치를 이용하여 세포의 생존율 감소를 50% 억제하는 50% effective dosage(ED50)를 산출하였다.

6. NO 생성량 측정

Raw 264.7 세포주로부터 생성된 NO의 양은 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로서 Griess 시약을 이용하여 측정하였다. 즉 세포 배양 상등액 50 μl와 Griess 시약(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid+1% α-naphthylamide in H2O) 50 μl 를 96 well plates에 혼합하고 암실에서 10분동안 반응시킨 후 540 nm에서 Automatic ELISA microplate reader로 흡광도를 측정하였다. NO2-의 농도는 sodium nitrate를 희석하여 흡광도를 측정하여 표준 곡선을 얻었다. 실험 결과는 무처리 대조군에 대한 ratio로 NO 생성량의 변화를 표시하였으며, 5회 반복 실험을 거쳐 산출된 평균 수치를 이용하여 각각의 물 추출물이 NO 생성량을 50% 억제하는 ED50를 산출하였다.

7. PGE2 생성량 측정

PGE2 생성량을 측정하기 위하여 6 well plate에 cells 5×105 CFU/ml을 분주하고, 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 추출물을 각각 농도 별로 처리한 다음, 1시간 후에 LPS 1 μg/ml를 처리하였다. LPS 처치 24시간 후 배지를 수거하여 PGE2 ELISA Kit(Pierce endogen, Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정하였다. 실험 결과는 무처리 대조군에 대한 ratio로 PGE2 생성량의 변화를 표시하였으며, 5회 반복 실험을 거쳐 산출된 평균 수치를 이용하여 물 추출물 각각의 ED50를 산출하였다.

8. Cytokine 생성량 측정

TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성량을 측정하기 위하여 6 well plate에 cells 5×105 CFU/ml을 분주하고, 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 추출물을 각각농도 별로 처리한 다음, 1시간 후에 LPS 1 μg/ml를 처리하였다. LPS 처치 12시간 후 배지를 수거하고, 각각의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 ELISA Kit를 이용하여 함량을 측정하였다. 실험 결과는 무처리 대조군에 대한 ratio로 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성량의 변화를 표시하였으며, 5회 반복 실험을 거쳐 산출된 평균 수치를 이용하여 각각의 cytokine에 대한 증가를 50% 억제하는 D50를 산출하였다.

9. 통계 처리

모든 수치는 5회 반복 실험의 평균±표준편차로 표시하였으며, 세포 생존율, NO, PGE2 및 Cytokine 생성량에 미치는 효과는 다중 비교 검증을 이용하여 통계처리를 실시하였다. 즉 분산 동질성을 Levene test를 실시하여 검증하고, 등분산일 경우 one way ANOVA test를 실시한 다음 least-significant differences(LSD) test로 사후 검증을 실시하여 군 간의 유의성을 측정하였고, 비등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal-Wallis H test를 실시하여 유의성이 인정된 경우에는 Mann-Whitney U(MW) test를 실시하여 군간의 유의성을 검증하였다. 모든 통계 처리는 SPSS for Windows(Release 14.0K, SPSS Inc., USA)를 이용하였으며, p-value가 0.05 이하인 경우 통계적 유의성을 인정하였다. 또한 ED50는 Probit 방법을 이용하여 SPSS for Windows(Release 14.0K, SPSS Inc., USA)를 이용하여 산출하였고, 후보 물질의 효과를 보다 명확히 하기 위하여 처리군과 비처리 대조군과의 percent change를 다음의 공식을 이용하여 측정하였다.

EQUATION. Percentage Changes as Compared with LPS Control (%) ={(Data of test material treated groups -Data of LPS control)/Data of LPS control)}×100

 

III. 결 과

1. 항균 활성도(MIC)

使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 물 추출물의 S. aureus에 대한 MIC를 표준 액체배지 희석법으로 평가한 결과, MIC는 각각 5.625±4.075(3.125~12.500), 0.332±0.273(0.098~0.782), 1.094±0.428(0.782~1.563), 2.969±2.096(0.782~6.250), 9.375±4.419(3.125~12.500) 및 >25 mg/ml로 관찰되어, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 使君子, 蕪荑 물 추출물 순으로S. aureus에 대한 항균력을 나타내었으나 榧子 물 추출물은 S.aureus에 대해 유의한 항균력을 나타내지 않는 것으로 관찰되었다. 한편 lincomycin의 MIC는 0.469±0.297(0.195~0.782) μg/ml로 관찰되었다(Table 2).

Table 2.MIC againstS. aureus Detected in This Study by Agar Microdilution Method

2. 세포 생존율의 변화

使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑, 榧子 물 추출물, piroxicam 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 세포 생존율의 증가가 각각 1 mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.01 mg/ml, 1mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.1 mg/ml, 5 μg/ml부터 인정되기 시작하였고, LPS 처리에 의한 세포 생존률 감소에 대한ED50는 각각 66.370 mg/ml, 2.908 mg/ml, 1.747 mg/ml, 259.553 mg/ml, 18.150 mg/ml, 34.160 mg/ml, 35.179 μg/ml로 산출되었다.

LPS 단독 처리군에서는 무처리 대조군에 비해 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑, 榧子, piroxicam 각각 -40.60%, -40.80%, -41.00%, -41.60%, -41.00%, -40.60%, -40.40%의 세포 생존율을 나타내었다.

使君子 물 추출물 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 mg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독처리군에 비해 각각 2.36, 9.43, 18.86, 24.58 및 37.04%, 苦楝皮 물 추출물에서는 1.01, 20.27, 34.12, 45.27 및 51.69%, 檳榔 물 추출물에서는 -1.36, 26.10, 39.66, 48.14 및 56.61%, 貫衆 물 추출물에서는 5.14, 8.90, 19.18, 23.63 및 32.88%, 蕪荑 물 추출물에서는 1.36, 8.81, 19.32, 37.29 및 38.64%, 榧子 물 추출물에서는 -2.69, 14.14, 21.55, 28.96 및 45.12%의 변화를 나타내었다. 마지막으로 piroxicam 1.25, 2.5, 5, 10 및 100 μg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독처리군에 비해 각각 3.02, 12.75, 30.20, 47.65 및 56.04%의 변화를 나타내었다(Fig. 1).

Fig. 1.Effects of Quisqualis Fructus, Meliae Cortex, Arecae Semen, Crassirhizomae Rhizoma, Ulmi Pasta Semen, Torreyae Semen Aqueous Extracts and Piroxicam on the Cell Viability in LPS Stimulated Raw 264.7 Cells.

3. NO 생성량의 변화

使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑, 榧子물 추출물, piroxicam 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) NO 생성량의 감소가 각각 0.1 mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.001 mg/ml, 1mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.1 mg/ml, 1.25 μg/ml 부터 인정되기 시작하였고, LPS 처리에 의한 NO 생성량의 증가에 대한 ED50는 각각 389.486 mg/ml, 0.294 mg/ml, 0.138mg/ml, 523.060 mg/ml, 45.363 mg/ml, 49.327 mg/ml, 6.552 μg/ml 로 산출되었다.

LPS 단독 처리군에서는 무처리 대조군에 비해 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑, 榧子, piroxicam 각각 425.60%, 446.40%, 428.20%, 434.40%, 433.40%, 415.20%, 425.80%의 NO 생성량의 변화가 인정되었다.

使君子 물 추출물 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 mg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독처리군에 비해 각각 -6.09, -6.85, -16.44, -21.73 및 -32.46%, 苦楝皮 물 추출물에서는 -19.33, -34.41, -41.29, -58.60 및 -68.67%, 檳榔 물 추출물에서는 -19.65, -34.72, -47.48, -64.03 및 -74.93%, 貫衆 물 추출물에서는 -1.12, -7.07, -16.39, -17.70 및 -27.13%, 蕪荑 물 추출물에서는 -11.47, -21.86, -25.65, -30.15 및 -46.01%, 榧子 물 추출물에서는 -8.54, -11.02, -21.70, -25.62 및 -44.45%의 변화를 나타내었다. 마지막으로 piroxicam 1.25, 2.5, 5, 10 및 100 μg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각-25.03, -30.81, -46.06, -69.49 및 -79.16%의 변화를 나타내었다(Fig. 2).

Fig. 2.Effects of Quisqualis Fructus, Meliae Cortex, Arecae Semen, Crassirhizomae Rhizoma, Ulmi Pasta Semen, Torreyae Semen Aqueous Extracts and Piroxicam on the NO Production in LPS Stimulated Raw 264.7 Cells.

4. PGE2 생성량의 변화

使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑, 榧子물 추출물, piroxicam 처리군에서는 LPS단독 처리군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) PGE2 생성량의 감소가 각각 0.1 mg/ml, 0.001 mg/ml, 0.001 mg/ml, 1 mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.1 mg/ml, 1.25 μg/ml부터 인정되기 시작하였고, LPS 처리에 의한 PGE2 생성량의 증가에 대한 ED50는 각각 114.271 mg/ml, 0.223 mg/ml, 0.046 mg/ml, 243.078 mg/ml, 8.829 mg/ml, 28.947 mg/ml, 1.162 μg/ml로 산출되었다.

LPS 단독 처리군에서는 무처리 대조군에 비해 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑, 榧子, piroxicam 각각 39425.00%, 39247.00%, 39734.40%, 39487.60%, 39684.00%, 39416.40%, 39534.00%의 PGE2 생성량의 변화가 인정되었다.

使君子 물 추출물 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 mg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -3.95, -6.80, -16.61, -26.05 및 -33.63%, 苦楝皮 물 추출물에서는 -19.66, -38.73, -50.86, -59.67 및 -63.19%, 檳榔 물 추출물에서는 -25.22, -46.13, -58.02, -66.98 및 -73.21%, 貫衆 물 추출물에서는 -0.14, -4.74, -7.88, -16.74 및 -26.94%, 蕪荑 물 추출물에서는 -7.44, -17.94, -21.18, -40.19 및 -49.53%, 榧子 물 추출물에서 는 -6.60, -11.37, -19.66, -33.84 및 -42.05%의 변화를 나타내었다. 마지막으로 piroxicam 1.25, 2.5, 5, 10 및 100 μg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -41.94, -59.07, -69.96, -77.87 및 -82.52%의 변화를 나타내었다(Fig. 3).

Fig. 3.Effects of Quisqualis Fructus, Meliae Cortex, Arecae Semen, Crassirhizomae Rhizoma, Ulmi Pasta Semen, Torreyae Semen Aqueous Extracts and Piroxicam on the PGE2 Production in LPS Stimulated Raw 264.7 Cells.

5. TNF-α 생성량의 변화

使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑, 榧子물 추출물, piroxicam 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) TNF-α 생성량의 감소가 각각 10 mg/ml, 0.001 mg/ml, 0.001 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.1 mg/ml, 1 mg/ml, 1.25 μg/ml부터 인정되기 시작하였고, LPS 처리에 의한 TNF-α 생성량의 증가에 대한 ED50는 각각 406.288 mg/ml, 0.343 mg/ml, 0.123mg/ml, 9404.227 mg/ml, 125.406 mg/ml, 140.775 mg/ml, 7.273 μg/ml로 산출되었다.

LPS 단독 처리군에서는 무처리 대조군에 비해 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑, 榧子, piroxicam 각각 1464.80%, 1468.80%, 1446.80%, 1456.20%, 1462.40%, 1446.20%, 1460.60%의 TNF-α 생성량의 변화가 인정되었다. 使君子 물 추출물 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10mg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -3.73, -3.51, -10.49, -12.45 및 -32.18%, 苦楝皮 물 추출물에서는 -13.46, -25.92, -41.85, -51.10 및 -78.30%, 檳榔 물 추출물에서는 -25.39, -32.74, -44.62, -59.32 및 -81.38%, 貫衆 물 추출물에서는 -5.33, -3.86, -9.92, -11.89 및 -24.75%, 蕪荑 물 추출물에서는 -6.66, -7.81, -13.79, -20.11 및 -40.28%, 榧子 물 추출물에서는 -5.95, -7.14, -11.15, -16.26 및 -40.91%의 변화를 나타내었다. 마지막으로 piroxicam 1.25, 2.5, 5, 10 및 100 μg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -29.19, -42.21, -50.07, -55.63 및 -69.88%의 변화를 나타내었다(Fig. 4).

Fig. 4.Effects ofQuisqualis Fructus, Meliae Cortex, Arecae Semen, Crassirhizomae Rhizoma, Ulmi Pasta Semen, Torreyae Semen Aqueous Extracts and Piroxicam on the TNF-α Production in LPS Stimulated Raw 264.7 Cells.

6. IL-1β 생성량의 변화

使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑, 榧子 물 추출물, piroxicam 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) IL-1β 생성량의 감소가 각각 1 mg/ml, 0.001 mg/ml, 0.001 mg/ml, 1mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.1 mg/ml, 1.25 μg/ml 부터 인정되기 시작하였고, LPS 처리에 의한 IL-1β 생성량의 증가에 대한 ED50는 각각 117.178 mg/ml, 0.135 mg/ml, 0.019mg/ml, 237.451 mg/ml, 7.923 mg/ml, 19.418 mg/ml, 7.101 μg/ml로 산출되었다.

LPS 단독 처리군에서는 무처리 대조군에 비해 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑, 榧子, piroxicam 각각 358.20%, 362.80%, 357.80%, 364.00%, 363.80%, 359.60%, 365.60%의 IL-1β 생성량의 변화가 인정되었다. 使君子 물 추출물 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 mg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -6.81, -7.20, -12.66, -20.73 및 -40.33%, 苦楝皮 물 추출물에서는 -22.34, -34.49, -50.86, -62.62 및 -71.91%, 檳榔 물 추출물에서는 -34.47, -46.88, -59.90, -71.38 및 -73.04%, 貫衆 물 추출물에서는 -8.28, -8.02, -14.22, -23.45 및 -36.85%, 蕪荑 물 추출물에서는 -4.79, -9.14, -17.51, -32.60 및 -53.99%, 榧子 물 추출물에서는 -2.61, -6.40, -15.19, -26.46 및 -45.52%의 변화를 나타내었다. 마지막으로 piroxicam 1.25, 2.5, 5, 10 및 100 μg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -27.06, -37.97, -44.97, -61.38 및 -75.39%의 변화를 나타내었다(Fig. 5).

Fig. 5.Effects of Quisqualis Fructus, Meliae Cortex, Arecae Semen, Crassirhizomae Rhizoma, Ulmi Pasta Semen, Torreyae Semen Aqueous Extracts and Piroxicam on the IL-1β Production in LPS Stimulated Raw 264.7 Cells.

7. IL-6 생성량의 변화

使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑, 榧子 물 추출물, piroxicam 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) IL-6 생성량의 감소가 각각 0.1 mg/ml, 0.001 mg/ml, 0.1 mg/ml, 1mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.1 mg/ml, 2.5 μg/ml 부터 인정되기 시작하였고, LPS 처리에 의한 IL-6 생성량의 증가에 대한 ED50는 각각 31.261 mg/ml, 0.105 mg/ml, 0.055mg/ml, 128.434 mg/ml, 2.290 mg/ml, 3.745mg/ml, 5.044 μg/ml로 산출되었다.

LPS 단독 처리군에서는 무처리 대조군에 비해 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑, 榧子, piroxicam 각각 2380.00%, 2392.60%, 2387.20%, 2365.60%, 2378.80%, 2360.00%, 2385.60%의 IL-6 생성량의 변화가 인정되었다.

使君子 물 추출물 0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10mg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -3.24, -10.56, -11.19, -24.67 및 -45.06%, 苦楝皮 물 추출물에서는 -22.96, -30.37, -50.74, -63.14 및 -81.06%, 檳榔 물추출물에서는 -26.32, -34.83, -52.28, -68.17 및 -86.60%, 貫衆 물 추출물에서는 -3.08, -9.94, -9.73, -18.71 및 -38.06%, 蕪荑 물 추출물에서는 -5.74, -14.71, -22.43, -49.48 및 -58.92%, 榧子 물 추출물에서는 -8.76, -6.37, -20.25, -44.27 및 -57.49%의 변화를 나타내었다. 마지막으로 piroxicam 1.25, 2.5, 5, 10 및 100 μg/ml 농도 처리군에서는 LPS 단독 처리군에 비해 각각 -28.36, -39.39, -51.52, -63.08 및 -84.32%의 변화를 나타내었다(Fig. 6).

Fig. 6.Effects of Quisqualis Fructus, Meliae Cortex, Arecae Semen, Crassirhizomae Rhizoma, Ulmi Pasta Semen, Torreyae Semen Aqueous Extracts and Piroxicam on the IL-6 Production in LPS Stimulated Raw 264.7 Cells.

 

IV. 고 찰

유방염은 유방의 피부, 한선, 유선 및 지방층에 발생하는 염증성 질환과 기타의 특수한 염증성 질환들을 포함하는 질환으로, 주된 원인균은S. aureus이며 18~50세의 여성에게 흔히 발생한다12). 유방염의 약 10%는 농양을 형성하는 화농성 유방염이나 유방농양으로 진행하 며 이때에는 절개하여 배농시키는데 배농이 완전하지 않으면 패혈증을 유발할 수 있으며, 드물게 瘡口不斂으로 인해 乳漏가 생성되기도 하므로 적절한 처치 와 치료가 필요하다6).

유방염을 비롯한 여러 감염성 질환의 치료를 위하여 새로운 항생제가 계속해서 개발되어 왔으나 penicillin의 부적절한 사용은 내성균주의 출현을 야기시켰으며13), S. aureus는 methicillin과 모든 β-lactams에 내성을 가진 methicillin resistanat Staphylococcus aureus(MRSA)로 진화하게 되어 vancomycin teicoplanin을 제외한 대부분의 항생제에 내성을 가지게 되었다14,15). 또한 MRSA에 의해 생기는 질병에 vancomycin을 사용한 결과 최후의 항생제라고 이야기되고 있는 vancomycin에 내성을 가진 vancomycin sensitive Staphylococcus aureus(VSSA) 또는 vancomycin resistant Staphylococcus aureus(VRSA)의 출현이 보고되고 있으므로 항생제의 사용을 줄이면서 효과가 우수한 대체 약물 혹은 천연물 유래의 치료제 개발이 시급한 실정이다.

한의학에서는 乳房이 紅腫熱痛하는 질환을 ‘乳癰’이라 하는데, 축적된 乳汁이 胃熱이나 外感之邪와 相搏하여 熱盛肉腐 하여 점차 乳癰을 형성한다고 보았으며, 膿未盛한 초기에는 活血敗毒, 風熱解散하여 疏散爲主로 하고, 膿已盛시에는 穿之排膿하며, 潰한 뒤에 不斂時에는 內托排膿한다6,16). 본 연구에 사용된 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 각각의 항균17-20), 항염21-27), 항감염28-34), 면역 조절35-39), 항산화40-49) 효과가 여러 연구를 통해 증명되어 왔으며, 이들은 殺蟲解毒劑에 해당하는 약재로 유방염의 주 원인균인 S. aureus에 항균력을 나타내는지 알아보기 위하여 본 연구를 계획하였다.

S. aureus에 대한 MIC를 표준 액체배지 희석법10)으로 측정하여 항균 효과를 평가하였으며, LPS로 활성화된 murine macrophage 세포주인 Raw 264.7 세포를 이용하여 세포 생존율, PGE2, NO, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 분비에 미치는 영향을 각각 평가하여 항균력은 S. aureus의 대표적인 항생제인 lincomycin과 비교하였고, 항염 효과는 piroxicam과 각각 비교하였다.

S. aureus에 대한 lincomycin의 MIC는 대략 1.56 μg/ml로 알려져 있는데50) , 본 실험의 결과에서도 0.469±0.297(0.195~0.782)μg/ml로 관찰되어 이전의 연구와 유사한 항균 활성이 인정되었다. 또한 piroxicam 의 LPS 처리에 의한 Raw 264.7 세포의 생존율, NO, PGE2, TNF-α, IL-1β및 IL-6 생성량 증가 억제에 대한 ED50 또한 각각 35.179, 6.552, 1.162, 7.273, 7.101 및 5.044μg/ml로 관찰되어, 5.30 μg/ml 전후에서 비교적 강력한 항염 효과를 나타낸다는 이전의 보고51)와 유사한 항염 효과가 인정되었다.

표준 액체배지 희석법에 의한 MIC 측정은 세균 및 다양한 감염증에 대한 후보 물질의 항균 활성을 측정하는 가장 기본적인 방법이다10,52,53). 본 실험의 결과 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 물 추출물의S. aureus에 대한 MIC는 5.625±4.075(3.125~12.500), 0.332±0.273(0.098~0.782), 1.094±0.428(0.782~1.563), 2.969±2.096(0.782~6.250), 9.375±4.419(3.125~12.500) 및 >25 mg/ml로 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 使君子, 蕪荑 물 추출물 순으로 S. aureus에 대한 항균력을 나타내었으며, 榧子 물 추출물은 S. aureus에 대해 유의한 항균력을 나타내지 않는 것으로 관찰 되었다.

대식 세포가 이물질에 대응할 때 분비 되는 여러 종류의 cytokine은 염증 반응을 매개하지만 과도한 분비는 숙주에 치명적인 결과를 초래할 수도 있으므로 대식 세포의 생존을 유지하면서 과도한 염증 반응을 매개하는 여러 가지 cytokine의 적절한 제어가 필수적이다. 본 실험 의 결과 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 물 추출물의 LPS 처리 Raw 264.7 세포 생존율에 대한 ED50가 각각 66.370, 2.908, 1.747, 259.553, 18.150 및 34.160 mg/ml로 관찰되어, 檳榔, 苦楝皮, 蕪荑, 榧子, 使君子, 貫衆의 순으로 대식세포 보호 효과를 나타내며, 특히 檳榔, 苦楝皮의 효과가 우수한 것으로 판단된다.

NO는 생리적 조건 하에서 혈관 긴장을 완화시켜주고, 호중 백혈구와 혈소판이 내피에 응집, 부착하는 것을 억제하는 등 유익한 기능을 가지고 있다54). 하지만 급성 염증 반응 시 과도하게 생성된 NO는 조직 손상의 원인이 될 수 있으며, 숙주 세포의 파괴, shock에 의한 혈관 확장과 염증 반응 유발에 의한 조직의 상해를 초래할 수 있으므로 NO의 적절한 제어가 필수적이다55). 본 실험의 결과 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 물 추출물의 LPS 처리에 의한 Raw 264.7 세포의 NO 생성량 증가 억제에 대한 ED50가 각각 389.486, 0.294, 0.138, 523.060, 45.363 및 49.327 mg/ml로 관찰되어 檳榔, 苦楝皮, 蕪荑, 榧子, 使君子, 貫衆의 순으로 과도한 대식 세포의 NO 생산 억제 효과, 즉 항산화 효과를 나타내며, 특히 檳榔, 苦楝皮의 효과가 우수한 것으로 판단된다.

PGE2 역시 NO와 유사하게 손상된 조직에서 통증과 발열에 관여하는 대표적인 염증 매개 물질로, 과량의 PGE2는 과잉의 면역 반응을 일으켜 각종 염증성 질환을 유발한다56). 따라서 PGE2 생성 억제는 염증과 통증을 완화시키므로 염증성 질환의 치료에 매우 유용한 것으로 알려져 있다56,57). 본 실험의 결과 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 물 추출물의 LPS 처리에 의한 Raw 264.7세포의 PGE2 생성량 증가 억제에 대한 ED50가 각각 114.271, 0.223, 0.046, 243.078, 8.829 및 28.947 mg/ml로 관찰되어, 檳榔, 苦楝皮, 蕪荑, 榧子, 使君子, 貫衆의 순으로 과도한 대식 세포의 PGE2 생산 억제 효과, 즉 항염 효과를 나타내며, 특히 檳榔, 苦楝皮의 효과가 우수한 것으로 판단된다.

TNF-α는 전 염증성 cytokine으로서 활성화된 호중성 백혈구와 대식 세포에의해 생산되며, 다양한 염증성 질환 및 자가 면역 질환에 있어서 염증의 개시 및 유지에 핵심적 역할을 하는 것으로 알려져 있다58,59). 또한 염증관련 cytokine중 IL-1β는 LPS 독성의 mediator로 알려진 전염증성 cytokine으로 생물학적 기능은 TNF-α와 유사하며 이들 두 cytokine들은 여러 형태의 실험에서 상호 상가 효과를 나타낸다60). IL-6는 전염증성 cytokine중의 하나로 간장의 Kupper cell과 monocytes 및 macrophage에서 생산되며, 림프구를 활성화시켜 항체 생산을 증가시키고, 염증 반응의 정도를 나타내는 지표가 된다 58,61). 본 실험의 결과 使君子, 苦楝皮, 檳 榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 물 추출물의 LPS처리에 의한 Raw 264.7 세포의 TNF-α생성량 증가 억제에 대한 ED50가 각각 406.288, 0.343, 0.123, 9404.227, 125.406 및 140.775 mg/ml, IL-1β 생성량 증가 억제에 대한 ED50가 각각 117.178, 0.135, 0.019, 237.451, 7.923 및 19.418 mg/ml, IL-6 생성량 증가 억제에 대한 ED50가 각각 31.261, 0.105, 0.055, 128.434, 2.290 및 3.745 mg/ml 로 관찰되어, 檳榔, 苦楝皮, 蕪荑, 榧子, 使君子, 貫衆의 순으로 세포 보호, 항염또는 항산화 효과를 나타내었고, 그 중 檳榔과 苦楝皮가 비교적 우수한 항균 및 항염 효과를 나타내었다.

이상의 결과에서 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 使君子, 蕪荑 물 추출물 순으로 S. aureus에 대한 항균력을 나타내었으며 榧子 물 추출물은 S. aureus에 대해 유의한 항균력을 나타내지 않는 것으로 관찰되었다. 또한 檳榔, 苦楝皮, 蕪荑, 榧子, 使君子, 貫衆의 순으로 세포 보호, 항염 또는 항산화 효과를 나타내었다. Lincomycin과 piroxiam의 심각한 부작용과 내성균 등장으로 새로운 치료제의 개발이 필요한 시점에서 殺蟲解毒劑에 속하는 한약재를 활용하여S. aureus에 대한 항균 및 항염력을 살펴본 본 연구 결과, 이들의 효력 은 lincomycin과 piroxicam에 미치지 못하지만 S. aureus에 대한 항균력과 항염효과가 입증되어 이들을 활용하여 유방염의 치료에 활용할 수 있을 것으로 기대된다. 특히 여섯 약재 중 檳榔, 苦楝皮가 비교적 우수한 항염 효과를 나타내어 이들을 활용한 여러 연구가 필요할 것으로 판단되며, 유방염 뿐만 아니라 다른 감염성 염증 질환에서도 비교적 우수한 효과를 나타낼 것으로 기대된다.

 

V. 결 론

使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 물 추출물의 S. aureus에 대한 항균력을 표준 액체배지 희석법으로 평가하였으며, LPS로 활성화된 murine macrophage 세포주인 Raw 264.7 세포를 이용하여 항염 효과를 평가한 결과는 다음과 같다.

1. S. aureus에 대한 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 물 추출물의 MIC는 5.625±4.075(3.125~12.500), 0.332±0.273(0.098~0.782), 1.094±0.428(0.782~1.563), 2.969±2.096(0.782~6.250), 9.375±4.419(3.125~12.500) 및 >25 mg/ml로 관찰되었다.2. 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 물 추출물의 LPS 처리 Raw 264.7 세포 생존율에 대한 ED50는 66.370, 2.908, 1.747, 259.553, 18.150 및 34.160 mg/ml 로 관찰되었다.3. 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 물 추출물의 LPS 처리에 의한 Raw 264.7 세포의 NO 생성량 증가억제에 대한 ED50는 389.486, 0.294, 0.138, 523.060, 45.363 및 49.327 mg/ml로 관찰되었다.4. 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 물 추출물의 LPS 처리에 의한 Raw 264.7 세포의 PGE2, 생성량 증가 억제에 대한 ED50는 114.271, 0.223, 0.046, 243.078, 8.829 및 28.947 mg/ml로 관찰되었다.5. 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 물 추출물의 LPS 처리에 의한 Raw 264.7 세포의 TNF-α 생성량 증가 억제에 대한 ED50는 406.288, 0.343, 0.123, 9404.227, 125.406 및 140.775 mg/ml로 관찰되었다6. 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 물 추출물의 LPS 처리에 의한 Raw 264.7 세포의 IL-1β 생성량 증가 억제에 대한 ED50는 117.178, 0.135, 0.019, 237.451, 7.923 및 19.418 mg/ml 로 관찰되었다.7. 使君子, 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 蕪荑 및 榧子 물 추출물의 LPS 처리에 의한 Raw 264.7 세포의 IL-6 생성량 증가 억제에 대한 ED50는 31.261, 0.105, 0.055, 128.434, 2.290 및 3.745 mg/ml로 관찰되었다.

이상의 결과에서 榧子 물 추출물은 S. aureus에 대해 항균력을 나타내지 않았으며, 나머지 약재들은 苦楝皮, 檳榔, 貫衆, 使君子, 蕪荑 물 추출물 순으로S. aureus에 대한 항균력을 나타내었다. 또한 檳榔, 苦楝皮, 蕪荑, 榧子, 使君子, 貫衆의 순으로 세포 보호, 항염, 항산화 효과를 나타내었고, 그 중 檳榔, 苦楝皮가 비교적 우수한 항균 및 항염 효과를 나타내었다.

□ 투 고 일 : 2014년 1월 21일 □ 심 사 일 : 2014년 2월 4일 □ 게재확정일 : 2014년 2월 10일