Effects of the Combined-Preparation of Crude Drugs on Pentobarbital-induced Sleeping Time

복합한약제제가 Pentobarbital에 의해 유도된 수면시간에 미치는 영향

Abstract

This experiment was performed to investigate whether 50% ethanol extracts of the combined-preparation of Longanae Arilus, Chrysanthemi Flos, Zizyphi Fructus and Ginseng Radix alba (CPE) has hypnotic effects and/or enhances pentobarbital-induced sleeping time. Locomotor activity was evaluated using a ambulometer of tilting-type. The sedative-hypnotic effects were evaluated by measuring the sleeping onset time and sleeping time in pentobarbital-treated mice 30 min. after oral administration of CPE and muscimol. The intracellular $Cl^-$ concentration of cerebellar granule cells was estimated using $Cl^-$ sensitive fluorescence probe N-(ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium (MQAE). CPE (150 mg/kg) decreased the locomotor activity, but CPE itself did not induce sleep. However, CPE reduced sleeping onset and prolonged sleeping time induced by pentobarbital (42 mg/kg). In addition, CPE (2 ${\mu}g/ml$) and pentobarbital (2.5 ${\mu}M$) itself did not affect on the chloride influx in primary cultured cerebellar granule cells, but the combination of CPE and pentobarbital (2.5 ${\mu}M$) increased the chloride influx onto the cells. In conclusion, it is suggested that CPE might augment pentobarbital-induced sleep through the increase of chloride influx.

서 론

불면증의 원인은 스트레스, 우울증, 불안증 등 심리적 요인, 카페인, 술, 담배 등 환경적 요인 등 매우 다양하다. 현재 임상에서 사용되고 있는 불면증 치료제로는 중추신경계의 억제성신경전달물질의 하나인 γ-amino butyric acid (GABA) 수용체에 작용하는 약물인 chlordiazepoxide, diazepam, flurazepam 등이 주로 사용되고 있다. 따라서 불면증 치료제를 개발하는데 중추신경계의 GABA system을 목표로 하는 것은 매우 중요하다. 현재 수면 및 진정제로 사용되고 있는 약물들은 중추신경계에 존재하는 neuronal membrane에 있는 GABAA 수용체복합체에 결합하여 Cl- 이온의 postsynaptic cell 내로 투과력을 증가시켜 GABA성 신경전달억제작용을 강화시키는 것으로 알려져 있다1).

GABA의 신경전달 억제작용을 강화시키기 위해서는 2가지 pathway가 있는데, 하나는 GABA의 합성을 촉진시키는 것이고, 다른 하나는 GABA 수용체에 결합하여 Cl- 이온의 세포 내 투과력을 증가시키는 방법이다. 이를 위해, 외국에서는 GABA 함유 식품들이 판매되고 있는데, 현재 우리나라에서는 GABA를 식품으로 허가하고 있지 않기 때문에 사용할 수가 없다. 따라서 GABA의 양을 증가시키는 방법으로, glutamic acid decarboxylase(GAD)를 활성화시키는 방법을 이용하여야 한다. 생체에서 GABA는 glutamic acid로부터 GAD에 의해 합성되기 때문에 GAD를 촉진시킬 수 있는 약물은 GABA의 합성을 촉진할 수 있다.

본 저자들은 식약청에서 식품으로 허가된 것 중 GABA의 합성을 촉진하거나, GABA 수용체에 작용하여 Cl- 이온의 세포 내 투과력을 증가시키는 식품을 찾기 위해 연구를 수행하고 있으며, 수종의 식품에서 효능이 있음을 확인하였다.

龍眼肉은 예로부터 補益心脾, 養血安神, 健忘失眠등에 사용되어 왔던 약재로서2), Okuyama 등3)은 불안 및 불면증에 효능이 있음을 보고하였으며, 본 저자들은 龍眼肉이 GABAA receptors의 α, β, γ subunits 중 γ subunit의 expression을 증가시켜 뇌세포 내로 Cl-의 유입을 증가시킴으로서 pentobarbital로 유도된 수면시간을 증가시킨다는 실험결과를 보고한 바 있다4).

또한, 甘菊5) 및 紅蔘6)은 GAD를 활성화하여, 大棗는 GAD 및 GABA receptor subunits 중 γ-subunit를 활성화하여 pentobarbital로 유도된 수면시간을 증가시킴을 보고하였다7). 한편, Lee 등8)은 人蔘이 수면-각성 장애시에 안정적 효과를 나타낸다고 보고하여 人蔘도 紅蔘과 비슷한 작용이 나타날 수 있음을 시사하였다.

전보9,10)에서 GABA의 신경전달 억제작용을 강화시키는 2가지 pathway에 각각 작용하는 식품을 혼합하면, 작용이 더욱 증강된다는 결과를 이미 보고한 적이 있다. 그러나 앞에서 제조한 제품들은 효능은 우수하였으나, 제조 판매하는데 많은 문제점들이 나타났다.

수면유도를 보조하는 식품을 개발하기 위해서는 정제보다는 효과가 빠르게 나타날 수 있는 액제로 개발하여야 하는데, 대부분의 액제는 제조할 때 첨가되는 다양한 첨가물 때문에 액성이 산성을 나타내게 되어, 함유된 주요 성분들이 서서히 분해되어 유효기간이 6개월 정도로 짧아지게 됨을 알게 되었다.

또한, 제조 원가는 제품의 최종 판매 가격의 40% 이하가 되어야 경제성이 있는데, 위에서 제조한 제제들의 원가는 60% 이상이 되어 판매하는데 문제점으로 지적되었기에, 원가가 낮고 효능이 있는 새로운 제제를 개발할 필요가 있었다.

따라서 본 실험에서는 원료 가격이 낮고 불면증에 효능이 있는 새로운 복합제제를 개발하고자, GABA receptor를 활성화하는 龍眼肉을 주약으로, GAD를 활성화하는 甘菊, GABA receptor와 GAD를 활성화하는 大棗에, 人蔘을 혼합하여 수면에 대한 효능을 측정한 결과 약간의 지견을 얻었기에 이에 보고하고자 한다.

 

재료 및 방법

1. 실험동물

본 실험에 사용한 실험동물은 생쥐 ICR계 수컷 20 ± 2 g, 흰 쥐 SD계 수컷 및 암컷 200 ± 20g을 대한실험동물(주)에서 구입하여 우석대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 사용하였으며(WS2013-007), 온도 20 ± 3 ℃, 습도 50 ± 5%, dark/light 12시간의 조건하에서 1 주일 이상 실험실에 적응시킨 후 사용하였다.

2. 시약

실험에 사용한 시약은 muscimol, cytosine arabinofuranoside는 Sigma Co.에서, basal Eagle's medium은 Life Technologies Co.에서, pentobarbital sodium은 Hanlim Pharm. Co.에서, N-(ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium (MQAE)는 Dojindo Co.에서, 구입하여 사용하였으며, 기타 시약은 cell culture용 및 1급 시약을 사용하였다. 사용기구는 ambulometer (AMB-10, O'Hara), CO2 incubator (Vision scientific Co.), FLUOstar (BMG Lab Technology) 등을 사용하였다.

3. 검액의 조제

龍眼肉은 미륭생약(주)이 태국에서 수입, 제조하여 광명생약기업부설연구소에서 제품 검사한 것을, 甘菊은 東山製藥에서 제조하여 ㈜광명생약실험실에서 검사한 식품의약품안전청 허가규격품을, 大棗는 국내산 (경산)으로 ㈜원광허브에서 검사한 것을, 人蔘은 金山産4년근으로 농협중앙회 인삼검사소에서 검사한 것을 전주 보화당에서 구입하여 사용하였으며, 복합한약제제의 처방구성은 Table 1과 같다. 4가지 약재를 혼합하여 50% ethanol로 4시간씩 2회 반복하여 가열 추출한 다음 여과하여 동결건조한 후 실험에 사용하였다 (수득율 16.3%, 이하 CPE라 함).

Table 1.Prescription of the combined-preparation of crude drugs

4. Locomotor activity 측정11)

Locomotor activity는 tilting-type의 ambulometer (AMB-10, O'Hara, Tokyo, Japan)로 측정하였다. 생쥐를 activity cage (직경 20 cm, 높이 18 cm)에 넣고 10분 동안 적응시킨 후, 약물을 경구 투여하였다. 생쥐 8마리를 1군으로 하여 대조군에는 생리식염수만을 투여하고, 실험군에는 CPE 50 및 150 mg/kg을 투여한 직후부터 1시간 동안 매 10분마다 counts를 읽어 자발운동량으로 하였다.

5. 생쥐의 수면유도 및 수면시간 측정

Anca 등의 방법12)을 변형시켜, 생쥐 12마리를 1군으로 하여 24 시간 동안 절식시킨 후, CPE 150 mg/kg을 경구투여 하고 30분 후에 pentobarbital 28 및 42 mg/kg을 복강으로 주사하고, 수면유도 및 수면시간을 측정하였다. 수면유도시간은 약물투여 직후부터 정향반사가 소실될 때 까지의 시간을, 수면시간은 정향반사가 소실될 때부터 정향반사가 회복될 때까지의 시간으로 하였다.

6. Pentobarbital로 유도한 생쥐의 수면유도시간 및 수면시간 측정

생쥐 10마리를 1군으로 하여 24 시간 동안 절식시킨 후, CPE 50 및 150 mg/kg을 경구투여 하였으며, 대조약물로는 강력한 GABA 효능제인 muscimol 0.2 mg/kg을 복강주사 하였다. 30분 후에 pentobarbital 42 mg/kg을 복강으로 주사하고, 수면유도시간 및 수면시간을 측정하였다. 수면유도시간은 pentobarbital을 복강으로 주사하고 정향반사가 소실될 때까지의 시간으로, 수면시간은 정향반사가 소실되는 시점에서 회복되는 시간으로 하였으며, pentobarbital 투여 후 15분 이내에 수면을 하지 않는 동물은 실험에서 배제하였다.

7. 뇌세포 분리 및 세포내 Cl- 양 측정13)

임신 8일째의 흰쥐에서 태아를 꺼내, 소뇌를 제거하고 뇌세포를 분리한 다음, 뇌세포 (5 × 106 cells/ml)를 10% FBS, penicillin-streptomycin (100 unit/ml), B-27 및 25 mM KCl이 함유된 DMEM/F-12 배지에서 24 시간 배양하였다. 배양 후 cytosine arabinofuranoside (10 μM)를 첨가해 비신경 세포의 성장을 막고, 5일 동안 배양하여 Cl- 양을 측정하였다. Cl-양의 측정은 신경세포에 MQAE (10 mM) 용액을 처리하여 12시간 방치한 후, 완충액 (pH 7.4, 2.4 mM HPO42-, 0.6 mM H2PO4-, 10 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1.0 mM MgSO4)으로 세척한 후, CPE 2 μg/ml, pentobarbital 2.5 μM, muscimol 20 μM을 각각 첨가하고, 즉시 FLUOstar (excitation wavelength: 320 nm, emission wavelength: 460 nm)로 Cl- 양을 측정하였다.

8. 통계처리

모든 실험 결과들은 mean ± S.E.M.로 나타내었고 통계처리는 Student's t-test를 실시하여 p<0.05를 기준으로 유의성 여부를 판정하였다.

 

결 과

1. CPE가 locomotor activity에 미치는 효과

대조군의 자발운동량은 523 ± 47회 이었으며, CPE 50 mg/kg을 투여하였을 때 자발운동량은 458 ± 38회로 대조군과 별 차이가 없었으나, CPE 150 mg/kg을 투여하였을 때는 392 ±35회로 대조군에 비해 자발운동량이 유의성 있게 감소하였다(Table 2).

Table 2.The locomotor activity was recorded during 1 hour after oral administration of CPE (50 and 150 mg/kg). Each value represents the mean ± S.E.M. (n=8). *; Significantly different from control group (p<0.05).

2. CPE 및 pentobarbital이 수면유도 및 수면시간에 미치는 효과

CPE 150 mg/kg을 투여하였을 때 생쥐 12마리 중 수면이 유도된 동물은 없었으며, pentobarbital 28 mg/kg을 투여하였을 때 생쥐 12마리 중 5 마리가 수면이 유도되었고 수면시간은 30.4 ±5.8분 이었으며, 42 mg/kg을 투여하였을 때는 생쥐 12마리 중 12 마리가 수면이 유도되었고 수면시간은 73.5 ± 6.2분이었다 (Table 3).

Table 3.Each value represents the mean ± S.E.M. (n=12).

3. CPE가 pentobarbital로 유도한 생쥐의 수면유도시간에 미치는 효과

Pentobarbital 42 mg/kg을 투여하였을 때 대조군의 수면유도시간은 3.5 ± 0.4분 이었으며, CPE 50 mg/kg을 투여하였을 때는 3.1 ± 0.3분으로 대조군과 별 차이가 없었으나, CPE 150 mg/kg을 투여하였을 때는 2.5 ± 0.2분으로, muscimol 0.2 mg/kg을 투여하였을 때는 2.2 ± 0.2분으로 대조군에 비해 모두 유의성 있게 단축되었다(Fig. 1).

Fig. 1.Effects of CPE on sleeping onset time in pentobarbitaltreated mice. Mice were fasted for 24 h before the experiment. Pentobarbital (42 mg/kg) was given intraperitoneally to mice 30 min. after administration of CPE and muscimol. Each value represents the mean ± S.E.M. (n=10). *; Significantly different from control group (*; p<0.05, ***; p<0.001).

4. CPE가 pentobarbital로 유도한 생쥐의 수면시간에 미치는 효과

Pentobarbital 42 mg/kg을 투여하였을 때 대조군의 수면시간은 76.2 ± 7.5분이었으며, CPE 50 mg/kg을 투여하였을 때 85.7 ± 7.8분으로 대조군과 별 차이가 없었으나, CPE 150 mg/kg을 투여하였을 때는 113.5 ± 9.8분으로, muscimol 0.2 mg/kg을 투여하였을 때는 127.3 ± 10.6분으로 대조군에 비해 모두 유의성 있게 연장되었다(Fig. 2).

Fig. 2.Effects of CPE on sleeping time in pentobarbital-treated mice. Each value represents the mean ± S.E.M. (n=10). *; Significantly different from control group (***; p<0.001).

5. CPE가 뇌세포내 Cl- ion 양에 미치는 효과

대조군의 뇌세포내 Cl-양은 14.5 ± 3.7 mM 이었으며, CPE 2 μg/ml를 처리하였을 때는 18.3 ± 4.8 mM로, pentobarbital을 2.5 μM 처리하였을 때는 18.3 ± 3.8 mM로, muscimol 20 μM 처리하였을 때는 20.7 ± 4.1 mM로 대조군에 비해 세포내 Cl-양이 별 차이가 없었다. Pentobarbital을 2.5 μM 처리하고 CPE 2 μg/ml 처리하였을 때는 75.8 ± 8.7 mM로, pentobarbital을 2.5 μM 처리하고 muscimol 20 μM 처리하였을 때는 82.6 ± 9.3 mM로 pentobarbital 2.5 μM 처리군에 비해 세포내 Cl-양이 유의성 있게 증가하였다(Fig. 3).

Fig. 3.Effects of CPE on chloride influx in primary cultured cerebellar granule cells. Each value represents the mean ± S.E.M. #; Significantly different from pentobarbital-treated group (###; p<0.001).

 

고 찰

많은 연구자들이 GABAergic system을 조절하는 물질을 찾기 위해 노력하고 있지만14-18), 식품에서 이러한 물질을 찾고 있는 경우는 거의 없는 실정이다. 본 저자들은 부작용이 적으면서 불면증을 치료할 수 있는 기능성식품을 개발하기 위해, 식약청에서 식품으로 허가된 천연물에 대해 수면에 대한 실험을 진행하였다. 식약청에서 식품으로 허가된 품목들은 부작용 및 안정성에 대한 실험을 별도로 할 필요가 없기 때문에 개발하는데 장점을 가지고 있다고 할 수 있다.

전보9,10)에서 개발한 제제들은 효능은 우수하였으나, 액제로 개발하였을 때 첨가물 때문에 액성이 산성이 되어, 주요 성분이 서서히 분해되어 유효기간이 6개월 정도로 짧아질 수 있음을 알게 되었다. 일반적으로 제조회사에서는 이를 극복하기 위하여 제조 공정에서 원료를 20~30% 정도 과잉으로 첨가하여 유효기간을 2년 정도로 연장하는 방법을 사용하고 있다. 이러한 점 때문에 원가가 더욱 높아져 판매하는데 문제점으로 지적되었다.

제제를 개발하여 판매하고자 할 때는 효능도 중요하지만 가격도 중요하다. 특히 기능성식품류는 의약품과 달리 효능이 신속하게 나타나지 않고, 지속적으로 복용하여야만 효능이 나타나는 경우가 많기 때문에 판매 가격이 중요하다고 할 수 있다. 일반적으로 제조 원가가 판매 가격의 40%를 넘게 되면 경제성이 없어지게 되어 판매하는데 장애가 된다. 따라서 제조 원가를 낮추는 것은 제품 개발에서 매우 중요하다고 할 수 있다.

본 저자들의 연구에 의하면 GABA receptor를 활성화하는 龍眼肉, GAD를 활성화하는 甘菊및 紅蔘, GABA receptor와 GAD를 활성화하는 大棗가 모두 alcohol 추출물이 우수한 효능을 나타내었기 때문에4-7), 본 실험에서도 龍眼肉, 甘菊, 大棗및 人蔘을 혼합하여 50% ethanol로 추출하여 (CPE) 제품을 개발하였다. CPE 50 mg/kg을 투여하였을 때 자발운동량은 대조군과 별 차이가 없었으나, CPE 150 mg/kg을 투여하였을 때는 대조군에 비해 자발운동량이 감소하였다. 이는 CPE가 고용량에서 약간의 진정작용이 있을 수 있음을 시사하는 것이다.

Pentobarbital은 28 mg/kg을 투여하였을 때 생쥐 12마리 중 5마리가 수면이 유도되었으며, pentobarbital은 42 mg/kg을 투여하였을 때는 12마리 중 12마리 모두가 수면이 유도되었기에, 이후 실험에서는 pentobarbital 42 mg/kg을 사용하였다. 또한, CPE 150 mg/kg을 투여하였을 때 생쥐 12마리 중 수면이 유도된 동물이 없었다는 결과는 CPE가 고용량에서 약간의 진정작용은 있으나, 직접적으로 수면을 유도하는 작용이 없음을 의미하는 것이라 할 수 있다.

Pentobarbital 42 mg/kg을 투여한 군을 대조군으로 하였을 때, pentobarbital 42 mg/kg을 투여하고 CPE 50 mg/kg을 투여하였을 때는 대조군에 비해 별 차이가 없었으나, pentobarbital 42 mg/kg을 투여하고 CPE 150 mg/kg을 투여하였을 때는 대조군에 비해 수면유도시간이 28.6% 단축되었으며, muscimol 0.2 mg/kg을 투여하였을 때는 대조군에 비해 수면유도시간이 37.1% 단축되었다.

Pentobarbital 42 mg/kg을 투여하고 CPE 50 mg/kg을 투여하였을 때는 대조군에 비해 별 차이가 없었으나, pentobarbital 42 mg/kg을 투여하고 CPE 150 mg/kg을 투여하였을 때는 대조군에 비해 수면시간이 49.0% 연장되었으며, muscimol 0.2 mg/kg을 투여하였을 때는 대조군에 비해 수면시간이 67.1% 연장되었다. 이 결과는 CPE가 pentobarbital에 의해 유도된 수면유도시간을 단축시키고 수면시간을 연장시키는 작용이 있으며, CPE 150 mg/kg의 작용은 muscimol 0.2 mg/kg을 투여하였을 때 보다 효력이 약함을 의미하는 것이다.

CPE의 수면유도 및 수면시간에 대한 작용기전을 규명하고자 신경세포 내 Cl- 양을 측정한 결과, CPE 2 μg/ml, pentobarbital 2.5 μM, muscimol 20 μM을 각각 단독으로 처리하였을 때는 대조군에 비해 별 차이가 없었다. 그러나 pentobarbital 2.5 μM을 전처리하고 CPE 2 μg/ml를 처리하였을 때와 pentobarbital 2.5 μM을 전처리하고 muscimol 20 μM을 처리하였을 때는 대조군에 비해 Cl- 양이 각각 유의성 있게 증가되었다.

본 저자들은 CPE 구성 성분인 龍眼肉은 GABA receptor subunits 중 γ-subunit의 expression을 증가시켜 pentobarbital로 유도된 수면시간을 증가시키며, 甘菊은 GABA 합성 효소인 GAD expression을 증가시켜 pentobarbital로 유도된 수면시간을 증가시키고, 大棗는 GABA 합성 효소인 GAD 및 GABA receptor subunits 중 γ-subunit의 expression을 증가시켜 pentobarbital로 유도된 수면시간을 증가시킨다는 실험결과를 이미 보고한 바 있다4-6).

결과적으로 龍眼肉, 甘菊, 大棗및 人蔘이 혼합된 CPE도 GAD 또는 GABA receptor를 통한 GABAergic system을 조절하여 세포 내로 Cl- 이온의 유입을 촉진하여, pentobarbital에 의해 유도된 수면효과를 증가시켰을 가능성이 있다고 추정되나, 자세한 기전은 추후 연구되어야 할 것이다.

 

결 론

龍眼肉, 甘菊, 大棗및 人蔘50% ethanol 추출물 (CPE)은 신경세포 내 Cl- 이온의 유입을 촉진함으로서, pentobarbital에 의해 유도된 수면유도시간을 단축하고 수면시간을 연장시켰다.