Effects of M1 RNA Internal Deletions on Stability of Upstream rnpB Transcripts

M1 RNA 내부 염기서열의 결실이 상위 rnpB 전사체의 안정성에 미치는 영향

실 험

균주 및 플라스미드. 사용된 대장균 RNase Ets 균주 MCE- (rne-3071 K12r-m+)이었다.10 플라스미드 pLMdd5-9, pLMdd5-50, pLMd23은 pLM1의 유도체이다.5,8 pLM1은 rnpB 유전자 지도의 -270 에서 +1286 까지의 KpnI-EcoRI DNA 절편을 포함하고 있는 pGEM3의 유도체이다11. pLMdd5-9, pLMdd5-50, pLMd23은 각각 rnpB 구조 유전자의 +139 ~ +330, +139 ~ +363, +36 ~ +57의 염기서열이 결실되어 있다.5,8

생체 내 RNA의 추출. 30 ℃에서 앰피실린(ampicillin) 50 μg/ml을 포함하는 LB에서 밤 새 키운 대장균을 같은 배지에 1:100으로 묽힌 후 A600가 0.6까지까지 진탕 배양하였다. 배양액을 둘로 나누고 하나는 30 ℃에서 다른 하나는 44 ℃로 계속 1 시간 동안 배양하였다. 배양액 0.7 ml 에 70 μl 의 10배 농도의 RNA 추출완충용액(RNA 추출완충용액: 0.02 M NaOAc, pH 5.2, 0.5% SDS, 1 mM EDTA)을 가한 다음 RNA 추출완충용액으로 포화된 페놀 700 μl을 가하고 65 ℃에서 20분간 페놀추출을 하였다. 수용액층에 다시 700 μl의 같은 페놀을 넣고 추출한 후 같은 부피의 이소프로필알코올을 가하여 -20 ℃에서 RNA를 침전시켰다.12

노던식 빨아들이기(Northern blot). RNA를 7 M 우레아를 포함하는 5% 폴리아클릴아미드 겔에서 분리한 후 나일론 막(Hybond-N; Amersham Pharmacia Biotech)로 전기이동(electrotransfer)하였다. 탐침 (probe)으로 사용된 반의미 M1 RNA(antisense RNA)는 pLMd23 DNA를 HindIII로 절단한 후 T7 RNA 중합 효소를 이용한 시험관내 전사반응을 통하여 얻었다.5 이때 [32P]CTP를 이용하여 RNA 내부를 32P로 표지화하였다.