Abstract
It is crucial to develop a miniaturized cultivation method for large and rapid screening of high-yielding mutants of monacolin-K, a powerful anti-hypercholesterolemic secondary metabolite biosynthesized by the fungal cells of Monascus ruber. In order to investigate as many strains as possible in a short time, a miniaturized fermentation method especially suitable for the cultivation of the filamentous Monascus mutants was developed using $50m{\ell}$ culture-tube ($7m{\ell}$ of working volume) instead of the traditional $250m{\ell}$ flask ($50m{\ell}$ of working volume). Generally, in filamentous fungal cell fermentations, morphologies in growth and production cultures should be maintained as thick filamentous and compact-pelleted (usually less than 1 mm in diameter) forms, respectively, for enhanced production of secondary metabolites in final production cultures. In this study, we intended to induce the respective optimal morphologies in the miniaturized culture system for the purpose of rapid screening of overproducers. Miniaturized growth culture system was successfully developed due to the mass production of spores in the statistically optimized solid medium. When large amounts of spores were inoculated into the growth cultures, and brown rice flour (20 g/L) was also supplemented to the growth medium, dense filamentous morphologies were successfully induced in the growth cultures performed with the 50 ml culture tubes. It was implied that the amounts of spores inoculated into the growth tube-cultures and the growth medium components should be the key factors for the induction of the filamentous forms in the growth fermentations. Furthermore, in order to statistically optimize production medium, multiple experiments based on Plackett-Burman design and response surface method (RSM) were carried out, resulting in more than 2 fold enhanced production of monacolin-K in the final production cultures with the optimized production medium. Notably, under the production culture conditions with the statistically optimized medium, optimal pellet sizes below 1 mm in diameter were reproducibly induced, in contrast to the thick and viscous filamentous morphologies observed in the previous production cultures.
가능한 한 대량의 균주를 테스트하여 고생산성을 지닌 균주를 신속히 선별하기 위해서는 소규모 액상배양 방법의 확립이 필수적인데, 강력한 지질저하제인 monacolin-K의 생산균주인 균사형성 Monascus의 경우 포자나 균사체의 형성이 활발하지 않은 배양 생리적 특성으로 인해 소규모 (miniature) 액상배양이 매우 어려운 문제점이 있다. 본 연구에서는 monacolin-K 고생산성 균주개량의 효율성을 큰 폭으로 증가시키고자, 기존의 플라스크 액상배양 방법을 소규모화시킨 tube 배양 방법을 개발함으로써 단기간에 보다 많은 양의 균주를 테스트하고자 하였다. 이차대사산물인 monacolin-K의 생합성은 각각의 배양단계에서의 생산균주의 배양형태가 중요한데, 특별히 최종 생산배양에서 생산성 증가에 심각한 영향을 미치는 배양형태인 직경 1 mm 이하의 pellet 모양을 유도하기 위해서는 성장배양 시에 반드시 고농도의 균사모양이 유도되어야 하는 것으로 관찰되었다. 50 ml tube (7 ml의 조업부피)를 이용하는 소규모 액상 성장배양의 경우 solid seed 배양 단계에서의 포자형성배지의 조성을 통계적 방법을 통해 최적화하고, 또한 성장배지 성분에 brown rice 가루 20 g/L를 첨가할 때, 원하는 균사모양의 배양형태가 유도됨을 확인할 수 있었다. 한편 7 ml의 조업부피의 tube를 이용한 소규모 성장배양 방법의 개발로 인해, 기존의 flask 배양을 이용할 때보다 단기간에 훨씬 많은 변이주의 생산성을 조사하게 되어 균주개량 속도를 큰 폭으로 향상시킬 수는 있었으나, 선별된 개별 균주의 monacolin-K의 생산성은 오히려 전체적으로 감소하는 경향을 보여 주었다. 이러한 결과는 소규모 배양방법을 확립하기 위해 새로이 개발한 포자형성배지와 성장배지의 조성변화로 인해 기존에 확립된 생산배지에서는 생산균주의 monacolin-K 생합성 능력이 최대로 발휘되지 않았기 때문에 발생한 것으로 판단되었다. 따라서 본 연구를 통해 확립된 소규모 성장배양에 적합한 최적의 생산배지 조성을 확립하고자 통계적 방법인 Plackett-Burman design을 적용하여 monacolin-K 생산성 향상에 영향을 주는 glycerol, malt extract, yeast extract, brown rice의 4가지 성분들을 최종 선별하였고, 또한 이들의 최적농도 결정을 위해 반응표면분석 실험을 수행하였다. 이와 같이 결정된 최적 생산배지를 사용하여 생산배양을 수행한 결과, monacolin-K의 생산성이 2배 이상 증가하고, 배양 형태 또한 용존산소와 영양분의 전달이 매우 용이한 직경 1mm 이하의 pellet 모양을 유지함을 확인할 수 있었다.
