Conformational free energy calculations using an empirical potential function (ECEPP/2) and the hydration shell model were carried out on the sulfonylurea herbicides of bensulfuron methyl (Londax) and metsulfuron methyl (Ally). The conformational energy was minimized from starting conformations which included possible combinations of torsion angles in the molecule. The conformational entropy of each conformation was computed using a harmonic approximation. To understand the hydration effect on the conformation of the molecule in aqueous solution, the hydration free energy of each group was calculated and compared each other. It was found that the low-free-energy conformations of two molecules in aqueous solution prefer the overall folded structure, in which an interaction between the carbonyl group of ester in aryl ring and the first amido group of urea bridge plays an important role. From the analysis of total free energy, the hydration and conformational entropy are known to be essential in stabilizing low-free-energy conformations of Londax, whereas the conformational energy is proved to be a major contribution to the total free energy of low-free-energy conformations of Ally.
Sulfonylurea herbicides are widely used in agriculture because they have a long residual period and high selectivity. An analytical method was developed using QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe) technique for simultaneous determination of sulfonylurea herbicide residues in agricultural products by liquid chromatography tandem mass spectrometry and for establishment MRL (Maximum Residue Limit) of those herbicides in Korea. Extraction was performed using acetonitrile containing 0.1% formic acid with MgSO4 (anhydrous magnesium sulfate) and NaCl (sodium chloride) and the extract was cleaned up using MgSO4 and C18 (octadecyl). The matrix-matched calibration curves were composed of 7 concentration levels from 0.001 to 0.25 mg/kg and their coefficients of determination (R2) exceeded 0.99. The recoveries of three spiking levels (LOQ, 10LOQ, 50LOQ, n=5) were in the range of 71.7-114.9% with relative standard deviations of less than 20.0% for all the five agriculture products. All validation values met criteria of the European Union SANTE/11312/2021 guidelines and Food and Drug Safety Evaluation guidelines. Therefore, the proposed analytical method was accurate, effective, and sensitive for sulfonylurea herbicide residues determination in agricultural commodities.
Sulfonylurea계 제초제에 대한 저항성 새성매자기가 한국의 서산 간척지 논에서 발생한 것이 확인되었다. 제초제 저항성 새섬매자기가 발생한 논은 담수직파 양식으로 벼를 재배하여 왔으며, 1990년부터 13년 동안 연속적으로 sulfonylurea계 혼합 제초제를 사용하고 있다. 온실 조건에서 서산과 무안에서 채취한 새섬 매자기 구경을 이식 후 10일에 azimsulfuron, bensulfuron-methyl, cinosulfuron, ethoxysulfuron, imazosulfuron 그리고 pyrazosulfuron-ethyl을 처리하였을 때 무안의 새섬매자기는 각 제초제 추천량에서 방제가 되었으나 서산의 새섬매자기는 추천량의 5배량에서도 20-40% 생존되었다. 생체중 50%를 억제하는 각 제초제의 농도 $(GR_{50})$는 두 지역에서 채취한 새섬매자기 간에 현저한 차이가 있었으며, 서산의 매자기에 대한 6 종류의 $GR_{50}$은 무안의 새섬매자기 대한 $GR_{50}$ 값 보다 $47\sim100$배 높게 나타났다. 또한 무안과 서산의 새섬매자기에서 추출한 acetolactate synthase(ALS)에 대한 pyrazosulfuron-ethyl의 50% 억제 농도$(I_{50})$각각 0.8 nM과 409 nM로 나타나, 서산의 새섬매자기가 무안의 새섬매자기 보다 511배 높은 저항성을 가지고 있음을 확인하였다.
본 실험은 한국 논에서 발생하고 있는 물옥잠의 SU계 제초제에 대한 저항성 메카니즘을 구명하기 위하여 ALS 활성, $[^{14C}]$bensulfuron의 홉수이행 및 ALS 유전자의 DNA 염기서열을 분석하였다. 한국 논에서 광범위하게 사용 중인 6 종류의 SU 계 제초제들에 대하여 저항성이 확인되었는데, 저항성 생태형에 대한 생체중 50% 저해 제초제 농도 $(GR_{50})$는 감수성 생태형에 비하여 약 4배에서 64배까지 높았다. SU계 제초제들 에 대한 저항성 생태형의 ALS 활성은 감수성 생태형 보다 훨씬 덜 민감하게 반응하였으며, 저항성 생태형에 대한 SU계 제초제들의 $I_{50}$값은 감수성 생태형 보다 14배에서 76배까지 높게 나타났다. 생태형간 ALS 활성 차이의 원인을 구명하기 위하여 $[^{14C}]$bensulfuron의 홉수이행 차이를 조사한 결과 생태형간 뚜렷한 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나 저항성 및 감수성 생태형의 ALS 유전자 염기서열을 분석한 결과 저항성 생태형의 ALS 유전자 아미노산 서열 중 각각 하나의 염기치환에 의하여 168번째 threonine이 serine으로, 189번째 histidine이 arginine로, 247번째 aspartic acid가 glutamic acid로 변이 된 것이 확인되었다.
본 연구는 7년 동안 연속적으로 sulfonylurea(SU)계 제초제를 사용한 남부지역의 논에서 발생한 들에 대한 저항성 잡초 올챙이고랭이의 제초제 반응과 방제법을 구명하기 위하여 실시하였다. 온실 조건에서 SU계 제초제에 대한 저항성 및 감수성 생태형을 파종 후 10일에 azimsulfuron, bensulfuron, imazosulfuron 그리고 pyrazosulfuron을 처리하였을 때 감수성 생태형은 각 제초제의 추천량에서 완전히 방제되었으나 저항성생태형은 추천량의 10배량에서도 $20{\sim}30%$ 생존되었다. 생체중 50%를 억제하는 각 제초제의 농도($GR_{50}$)는 두 생태형 간에 현저한 차이가 있었으며, 조사된 4종류의 각 SU계 제초제들에 대한 $GR_{50}$는 감수성 생태형에 비해 $53{\sim}88$배 높게 나타났다. 또한 SU계 제초제 저항성 및 감수성 생태형의 올챙이고랭이로 부터 추출한 acetolactate synthase(ALS)에 대한 bensulfuron-methyl과 pyrazosulfuron-ethyl의 50%억제 저항성 생태형이 감수성 생태형보다 각각 498 및 126배 높게 나타났다. SU계 제초제 저항성 올챙이고랭이는 조기진단법에 의하여 적어도 3일 이내에 저항성 진단이 가능하였다. 올챙이고랭이 $1.5{\sim}2.5$엽기에서는 조사된 대부분의 비SU계 제초제들이 효과적이었으나 3.5엽기에서는 carfentrazone-ethyl, pyrazolate, simetryne가 매우 효과적이었다. 그리고 azimsulfuron+carfentrazone-ethyl+pyraminobac 입제와 pyraminobac+pyrazosulfuron+carfentrazone 입제는 벼에 약해 없이 SU계 저항성 올챙이고랭이에 매우 효과적이었다. SU계 혼합 제초제를 처리 후 생존한 저항성 올행이고랭이는 경엽처리제인 bentazone에 의해서 효과적으로 방제되었다.
Acetolactate Synthase(ALS)는 가지를 가진 아미노산 valine, leucine, isoleucine의 생합성 과정에서 공통적으로 작용하는 효소이다. ALS는 서로 구조적 유사성이 없는 최근에 개발된 sulfonylurea, imidazolinone, 그리고 trizolopyrimidine계 제초제들의 공통적인 작용표적이다. 완두로부터 분리한 ALS를 이용하여 새로 합성한 4,6-dimethoxypyrimidine 유도체들의 저해활성을 측정하였다. 가장 우수한 저해활성을 나타내는 유도체는 K11570으로 $IC_{50}$값이 0.2 ${\mu}M$이다. 완두의 ALS에 대한 K11570의 저해활성은 incubation 시간이 증가함에 따라 증가하였으며, 기질 pyruvate에 대해 혼합형 저해유형을 보여주었다. K11570와 sulfonylurea Ally, 그리고 feedback 저해제 leucine에 대한 dual inhibition 실험결과 이들 저해제의 결합부위가 최소한 부분적으로 겹치는 것으로 생각된다. Arg을 변형시킨 효소는 K11570, sulfonylurea Ally, 그리고 leucine의 저해 민감도의 변화가 관찰되었으나, Trp의 변형은 저해 민감도에 영향이 없었다.
분지 아미노산 생합성 효소인 ALS의 활성(活性)을 억제하는 sulfonylurea계 2약제 및 imidazolinone계 2약제를 대상으로 32초종에 대한 약제별 살초(殺草) 반응성 및 옥수수, 밀, 콩의 ALS 활성(活性) 억제 반응성을 통하여 ALS 활성(活性) 억제작용(抑制作用)과 살초작용(殺草作用)의 관계를 조사하였다. 1. Sulfonylurea계의 2가지 제초제(除草劑)들의 살초(殺草)스펙트럼은 적은 처리량에서도 매우 넓었으며, 내성(耐性)을 보였던 식물은 발아전 토양처리에서 밀, 보리, 개밀, 메귀리 등이었고, 발아 후 경엽처리에서 밀, 보리, 까마중, 왕바랭이, 개밀, 미국개가장, 메귀리 등이었다. 2. Imidazolinone계 2종의 제초제(除草劑)들에 대하여 내성(耐性)을 보였던 식물은 발아 전 처리에서 콩, 자귀풀, 도깨비바늘, 메귀리, 개밀 등이었고, 발아후 처리에서 콩, 자귀풀, 크로바 등으로 두과식물이었다. 3. Sulfonylurea 및 imidazolinone계 제초제(除草劑)들에 대하여 공통적으로 감수성(感受性)인 식물은 옥수수와 수수, sulfonylurea계에 감수성(感受性)을 보이면서 imidazolinone계에 내성(耐性)을 보였던 식물은 콩, 크로바, 자귀풀 등 두과식물이었다. 이와 대조적으로 sulfonylurea계에 내성(耐性)을 보이면서 imidazolinone계에 감수성(感受性)을 보였던 식물은 밀과 보리, 공통적으로 내성(耐性)을 보였던 식물은 개밀등 이었다. 4. Sulfonylurea계 약제에 대하여 온실 실험에 서 얻은 초종별 $GI_{50}$ 값과 각 초종으로부터 추출한 ALS 활성(活性) 억제 $IC_{50}$ 값은 경향이 일치하지 않았다. 5. Imidazolinone계 약제에 대하여 온실 실험에서 얻은 초종별 $GI_{50}$ 값과 각 초종으로부터 추출한 ALS 활성(活性) 억제 $IC_{50}$ 값은 경향이 유사(類似)하였다.
2010년까지 국내 논에서 설포닐우레아(sulfonylurea : SU)계 제초제들에 대한저항성잡초로 확인된 잡초들 1998년도에 충남서산 간척지 논에서 물옥잠이 확인이후 일년생 물달개비, 올챙이고랭이, 알방동사니 등 7초종, 다년생 올미, 새섬매자기 등 다년생 잡초 3초종이 발생하여 총 10초종이다. 그리고 2009년 ACCase 및 ALS 저해제들에 대한 저항성 피가 담수직파 논의 서 남부지역에서 처음 확인되었다. 초기에는 SU계 제초제들에 대한 저항성잡초들인 물달개비, 올챙이고랭이, 알방동사니 등은 하나의 논 필지에 하나의 초종들이 발생을 하였으나 최근에는 하나의 필지에 다수의 초종들이 동시적으로 발생하고 있다. 2008년도에 전국 861필지의 논에서 채취한 토양에서 발생하고 있는 물달개비 및 올챙이고랭이의 저항성 비율은 각각 42% 및 23%로 나타났다. 저항성잡초들의 생체중을 50% 억제한 농도($GR_{50}$)는 저항성 계통이 감수성 계통에 비해 수 십배에서 수 천배 높게 나타났다. ACCase 및 ALS 저해 제초제들인 cyhalofopbutyl, pyriminobac-methyl, penoxsulam 저항성 강피에 대한 저항성 계통의 $GR_{50}$은 감수성 계통에 비해 각각 14, 8, 11배나 높게 나타났다. 한국의 논에서 제초제 저항성의 다발생과 확산의 원인은 크게 잡초측면과 제초제 측면으로 구분할 수 있다. 잡초측면에서는 종자생산량과 발아율이 높은 잡초들 즉 물달개비, 올챙이고랭이 등이 저항성잡초로 변화한다. 그리고 제초제 측면은 저항성잡초 유발의 원인인 선택성이 탁월하고 약효지속성이 매우 긴 SU계 제초제들의 광범위한 사용이다. SU계 제초제들의 생산 품목들과 처리 논 면적의 비율은 각각 69%와 96%이다. 그리고 2003년까지 처리면적으로 본 선호도 10위까지 제초제들은 대부분 SU계 제초제들이 혼합된 "일발처리제"들이다. 직파재배 논에서 ACCase 및 ALS들이 혼합된 제초제들의 연용은 제초제 저항성 피를 유발하였고, 이는 피에 효과적인 SU계 제초제들인 pyrazosulfuron-ethyl 및 imazosulfuron과 무관하지 않다. SU계 제초제들에 대한 물옥잠의 저항성 계통의 $I_{50}$은 감수성 계통에 비해서 14배에서 76배 높았는데, 이는 제초제의 흡수 및 이행에 의한 차이보다는 ALS 유전자의 점 돌연변이(point mutation)에 의한 것으로 나타났다. 즉 ALS 유전자 아미노산 197번째 proline이 serine로 변화되었기 때문이다. 제초제 저항성잡초 방제로 benzobicyclone, bromobutide 등은 광엽 및 방동사니과 잡초들을 동시에 방제가 가능하다. 그리고 ACCase 및 ALS 저항성 피의 방제는 mefenacet, fentrazamide, cafenstrole로 2엽기까지 방제가 가능하다. 그러나 앞으로 국내 논에서 제초제 저항성잡초 및 관리에 대해서는 많은 문제점들을 내포하고 있다. 첫째, 현재까지 제초제 저항성 유발 약제들인 ALS 및 ACCase 저해제들의 사용량이 증가하기 때문에 제초제 저항성 잡초들은 계속 발생할 뿐만 아니라 더욱 빠른 속도로 확산할 것이다. 둘째, 미국, 유럽, 호주 등 선진국들과 같은 제초제 저항성잡초를 연구할 수 있는 전문 연구기관과 인력이 부족하다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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