Polyphenol oxidase (PPO) was purified from fresh ginseng roots using acetone precipitation, carboxymethyl (CM)-Sepharose chromatography, and phenyl-Sepharose chromatography. Two isoenzymes (PPO 1 and PPO 2) were separated using an ion-exchange column with CM-Sepharose. PPO 1 was purified up to 13.2-fold with a 22.6% yield. PPO 2 bound to CM-Sepharose, eluted with NaCl, and was purified up to 22.5-fold with a 17.4% yield. PPO 2 was further chromatographed on phenyl-Sepharose. The molecular weight of the purified PPO 2 from fresh ginseng was determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and was about 40 kDa. The optimum temperature and pH were $20^{\circ}C$ and 7.0, respectively, using catechol as a substrate. Pyrogallol showed the highest substrate specificity. The effect of a PPO inhibitor showed that its activity increased slightly in the presence of a low concentration of citric acid. High concentrations of acidic compounds and sulfite agents significantly inhibited purified ginseng PPO 2.
단백질 분해효소로서 넓은 특이성을 가지고 있는 Pronase를 사용하여 두 가지의 다른 방법으로 고정화효소(固定化酵素)를 제조하였다. Sepharose에 직접 결합시킨 효소는 원래 효소활성도의 22.6%을 유지하고 있었지만, Extension arm으로서 $-CH_2-$ 기의 수가 6, 10, 12를 가진 ${\omega}-amino-alkyl\;group$을 사용하여 Sepharose에 결합시킨 효소는 원래 효소활성도의 거의 100%를 다 유지하고 있었다. 제조한 고정화효소(固定化酵素)의 pH효과, 온도효과 및 Km을 조사하였으며 GRAS list에 들지 않은 Pronase를 식품가공에 이용하는 가능성을 고찰하였다.
우유의 지방분해 효소인 리파제를 분리 연구하기 위하여 홀몬처리 되지 않은 정상유와 홀몬 처리된 비정상유에서 리파제를 Heparin-Sepharose-CL-6B를 이용하여 분리 정제하였다. Heparin-Sepharose에 친화력을 조사한 결과 두 개의 효소활성이 있는 성분이 구분되었으며 한 성분은 Heparin-Sepharose-CL-6B에 결합되었고 다른 한 성분은 결합되지 않은 채 분리되었다. 친화성 크로마토그램에 결합되어 분리 정제된 리파제의 최적 온도, 최적 pH, 기질 특이성, 분자량 및 BSA의 활성제로서의 작용등 여러 가지 효소특성은 모두 동일한 것으로 나타났다. 그러나 홀몬처리된 소에서 얻은 우유의 경우에는 또 다른 호소활성 성분이 나타나 있음을 알았다. 이 lipolytic activity가 있는 성분은 Heparin-Sepharose-CL-6B에 친화력을 보이지 않았으므로 정상적인 milk lipase와는 구별된다. 따라서 홀몬처리된 소에서 얻은 우유에 함유된 성분중 Heparin-Sepharose에 결합된 효소는 유지방 자동산화에 영향을 끼치지 않으며 Heparin-Sepharose에 결합되자 않은 활성이 있는 성분은 자동산패에 영향을 크게 미친다고 볼 수 있다. 그 이유는 hormone의 불균형 상태로 인하여 생유에 자동산패가 일어날 수 있으며 이것은 비정상적으로 분비된 리파제 출현 사이에 연관관계가 있음을 의미한다.
Recombinant protein G has been utilized in the purification of antibodies from various mammalian species based on the interaction of antibodies with protein G. The interaction between immunoglobulin and protein G may not be restricted to the Fc protion of antibodies, as many different $F(ab)_2$ or Fab fragments can also bind to protein G. I found both FAb $F(ab)_2$ of 145-2C11, a hamster anti-mouse $CD3{\varepsilon}$ antibody, bound to the protein G-sepharose. Interestingly, Fab and $F(ab)_2$ of 145-2C11 did not bind to the protein A-sepharose. The binding of Fab and $F(ab)_2$ of 145-2C11 to protein G provided a useful method to remove proteases, chopped fragments of the Fc region, and other contaminating proteins. The remaining intact antibody in the protease reaction mixture can be removed by using a protein A-sepharose, because the Fab and $F(ab)_2$ portions of 145-2C11 did not bind to protein A-sepharose. The specific binding of Fab and $F(ab)_2$ portions of 145-sC11 to a protein G-sepharose (though not to a protein A-sepharose) and binding of intact 145-2C11 to both protein A- and G-sepharose will be useful in developing an effective purification protocol for Fab and $F(ab)_2$ portions of 145-2C11.
위염, 위궤양 및 위암의 원인 균인 Helicobacter pylori 가균체 표면에 다량 함유하며 주된 생존 인자이며 병원성 인자인 urease를 대장균에서 발현시키고 이 효소에 대한 항체 또는 기질과의 특이 상호 작용을 이용하여 두 단계의 간편한 방법에 의하여 정제하였다. 우선 anti-H. pylori Urease IgG-Sepharose column과 urea-Sepharose column을 각각 제조하고 DEAE-Sepharose 음이온 교환수지를 통하여 1차 정제한 시료를 각각 적용하고 제반 조건에서 용출시켰다. Anti-H. pylori urease IgG-Sepharose column의 경우에는 urease 시료가 너무 강력하게 결합함으로써 극단적인 pH조건에서만 용출이 가능함이 관찰되었으므로, 100 mM 탄산 완충액(pH 10.5)으로 최종 용출하였을 때 비교적 순수한 효소를 얻었으나, 비활성이 다소 감소된 것으로 나타났다. 한편, urea-Sepharose에 적용시킨 시료는 100 mM urea-HEB 완충액(pH 7.5)으로 비교적 용이하게 용출되어 비교적 높은 순도와 비활성의 urease 효소를 얻을 수 있었으나 이 경우에는 urease의 smaller subunit인 UreA peptide band의 강도가 다소 감소한 것이 관찰되었다.
Invertase의 고정화에 대해서 두가지 carrier matrix를 사용하여 연구하였다. Sepharose에 ${\omega}-aminohexylarm$를 붙인 후 효소를 결합시키는 indirect coupling method와 cellulose에 phenexyacetyl group의 linkage를 만들어 변형시킨 후 (modified cellulose), 여기에 효소를 흡착시키는 hydrophobic adsorption method로서 제조하였다. 각각의 고정화 수율(immobilized yield)은 ${\omega}-aminohexyl\;sepharose$의 경우 첨가한 효소의 26.0%의 activity를 고정화 시킬 수 있었으며, phenoxyacetyl cellulose의 경우는 72.9%였다. 제조한 고정화 효소의 안정성, ph영향, 온도 영향 및 Km값을 조사하였다. ${\omega}-aminohexyl\;Sepharose$에 고정화시킨 invertase근 최적 pH 4.5, 최적 온도 $60^{\circ}C$, 활성화 에너지 $5,941\;cal/mole{\cdot}deg$, Km값 22.2 mM이었으며 phenoxyacetyl cellulose에 고정화시킨 invertase는 최적 pH 4.0, 최적 온도 $60^{\circ}C$, 활성화 에너지 $7,769\;cal/mole{\cdot}deg$, Km 값 69.9mM이었다.
We isolated two Cd-binding high molecular weight proteins from intraperitoneally cadmium injected rat liver. Molecular weight of Cd-BP(I) purified from Sephacryl S-100 and DEAE Sepharose column chromatography and Cd-BP(II) purified from DEAE Sepharose column chromatography and Sulphonyl Sepharose column chromatography was 33,000 and 18,400, respectively. Alcohol dehydrogenase and alkaline phosphatase acitivities were not detected from two purified proteins.
본 연구에서는 형질전환된 식물세포배양으로 생산한 (hGM-CSF)를 cationic exchange resin인 CM-sepharose와 anionic exchange resin인 DEAE-sepharose에 통과키며 pH의 변화를 주었을 때 흡착 여부를 확인하였다. hGM-CSF는 pH가 5-7사이의 범위에서 가장 안정함을 보였으며 이 결과를 바탕으로 각각의 pH 범위를 결정하였다. Buffer exchange를 했을 때 cationic exchange resin인 CM-sepharose의 경우 pH 4.8에서 상대적으로 가장 높은 흡착율(77%)을 보였으며 anionic exchange resin인 DEAE-sepharose를 이용한 흡착에서는 pH 5.5에서 높은 흡착율(74%)을 보였다. 이러한 결과를 바탕으로 buffer exchange 없이 hGM-CSF가 secretion된 배지를 pH를 맞춘 후 좁은 범위에서의 흡착 실험을 수행하였다. 그 결과 pH 4.6에서 CM-sepharose를 이용했을 때 흡착율이 84%로 가장 좋았다. 이러한 결과를 이용하면 외래 단백질을 생산하는 식물세포 배양시에 가장 문제가 되는 protease에 의한 목적 단백질의 degradation을 해결할 수 있는 in situ adsorption이 가능하리라 사료된다.
흰느타리버섯(Pleurotus cornucopiae(Per.) Rolland)중의 단백질을 선택적으로 분리정제하기 위하여 AH-Sepharose 4B를 출발 물질로 하여 benzoyl-AH-Sepharose 4B를 합성하여 친화성 크로마토그래피하였다. 1) AH-Sepharose 4B 중의 amino기의 capacity는 겔 Iml 당 $9.5{\mu}mol$ 이었으며 합성겔의 리간드인 benzoyl기의 capacity는 겔 1ml당 $9.3{\mu}mol4이었다. 2) 친화성이 있는 단백질의 총 겉보기 분자량은 255,000 돌톤 이었으며, 이는 29,500, 31,500, 34,000, 71,000 및 89,000돌톤 단백질의 복합체였다. 3) 친화성 단백질 중의 아미노산 함량은 비극성 아미노산이 45.68%, 극성 아미노산이 26.93%, 양성 아미노산이 11.81%, 그리고 음성 아미노산이15.58%였다. 4) 소수성 benzoyl기에 친화성이 있는 단백질은 비극성인 것이 선택적으로 분리되었다.
정제, 농축된 free CGTase 는 pH 6.0 - 7.0의 범위에서 안정하였으며, $70^{\circ}C$정도의 고온에서도 안정한 특성을 가지고 있었으며, CGTase의 고정화를 위한 방법으로서 CNBr-activated sepharose 4B에 의한 고정화가 가장 높은 효율올 나타내는 것으로 결정되었다. 고정화의 최적조건은 $30^{\circ}C$, 60rpm, pH 6.0의 phosphate buffer 하에서 9 시간 동안 고정화하는 것이었고, CNBr-activated sepharose 4B를 이용한 고정화의 경우 실험에 사용된 다른 모든 이온교환 수지에서 얻어진 효율에 비해 월등한 효과를 보였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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