• Reproductive and Developmental Biology
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• 제41권4호
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• pp.65-70
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• 2017

Alpha-linolenic acid (ALA) is one of n-3 polyunsaturated fatty acids and found mainly in the chloroplasts. Many studies have been reported that intracellular reactive oxygen species (ROS) in mammalian oocytes were reduced by supplementation of ALA in in vitro maturation (IVM) medium. Based on these reports, we expected that ALA acts as an antioxidant during IVM of porcine oocytes. Therefore, the objective of this study was to investigate the antioxidant effect of ALA supplementation during IVM in porcine oocytes. The cumulus-oocyte complexes (COCs) were incubated in IVM medium containing $200{\mu}m$ $H_2O_2$ or $H_2O_2$ with $50{\mu}m$ ALA for 44 h. Nuclear maturation stage of oocytes was evaluated using aceto-orcein method. For measurement of oxidative stress state, intracellular ROS and glutathione (GSH) levels were measured using carboxy-DCFDA and cell tracker red, respectively. In results, oocytes in metaphase-II (MII) stage development was significantly reduced in $H_2O_2$ group compared to non-treated control group $61.84{\pm}1.42%$ and 80.00%, respectively; p<0.05) and it was slightly recovered by treatment of ALA ($69.76{\pm}1.67%$; p<0.05). The intracellular GSH levels was decreased in $H_2O_2$ groups compared with control groups, but it was enhanced by ALA treatment (p<0.05). On the contrary, $H_2O_2$ treatment increased intracellular ROS level in oocytes and $H_2O_2$-induced ROS was decreased by treatment of ALA (p<0.05). Our findings suggested that ALA treatment under oxidative stress condition improve oocyte maturation via elevated GSH and reduced ROS levels in oocytes. Therefore, these results suggest that ALA have an antioxidative ability and it could be used as antioxidant in in vitro production system of porcine embryo.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제7권1호
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• pp.15-22
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• 2003

Fas는 세포자연사를 유도하는 세포 표면 수용체 단백질로서 면역계에서 중요한 역할을 한다. 이러한 Fas mRNA는 림프조직뿐만 아니 라 비 림프조직에서도 발현한다. 한편 대다수의 난포들은 세포자연사와 연관된 기 작을 통해 난포폐쇄로 진행되는 것으로 알려지고 있으나, 난포폐쇄에 관한 기작은 아직 규명되지 않았다. 따라서 본 연구의 목적은 먼저 생쥐의 난소의 과립세포와 난자에서 Fas와 Fas ligand의 발현 여부를 알아보고, Fas와 Fas ligand발현과 난포폐쇄와의 상관 관계를 알아보고자 하였다. RT-PCR을 수행한 결과, 난소내 과립세포와 난자에서 Fas와 Fas ligand mRNA가 모두 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 면역조직화학적 염색 결과 또한, 원시 난포를 제외한 모든 발달 중인 난포의 과립세포와 난자들에서 Fas와 Fas ligand가 검출되는 것을 확인하였고, 특히 폐쇄를 보이는 난포에서 강한 발현을 보였다. 한편, 난소에서 세포자연사를 확인하기 위해 TUNEL 염색을 수행한 결과, TUNEL 양성을 보이는 과립세포와 난자의 수는 건강한 정상 난포에 비해 폐쇄난포에서 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 이상의 결과들은 난소내 과립세포와 난자에서 Fas와 Fas ligand 발현과 난포폐쇄와 상관 관계가 있음을 보여주고 있으며, 이러한 Fas와 Fas ligand가 생쥐 난소내 난포폐쇄 유발에 관여하고 있을 것으로 사료된다

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제4권1호
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• pp.53-59
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• 2000

내분비계 장애물질은 생체내에서 호르몬 등의 내분비계에 영향을 주기 때문에 미량으로도 생식기능에 이상을 가져 올 수 있고, 급ㆍ만성 독성과는 달리 차세대에 그 영향이 발현될 수 있다. 대부분의 내분비계 장애물질은 에스트로겐 유사물질로 알려져 있으며, 내분비계 장애물질의 하나인 bisphenol A (BPA)도 이러한 성질을 가진 물질이다. 본 연구는 BPA가 생쥐의 정자형성과정에 어떤 영향을 미치는가를 분석하고자, 농도별 (저농도, 20 mg/kg, 고농도 200 mg/kg) 구강투여를 실시하였다. 정자수와 테스토스테론 농도 및 산자수가 대조군에 비해 처리군에서 점진적으로 감소하는 경향을 보였으며, 산자수에서 유의적인 차이(P<0.01)를 나타내었다. 특히 국부적이긴 하지만 세정관 내강에서의 정자세포 소실 양상은 정자수의 감소 원인으로 사료된다. 성성숙 이후 정소에서의 발현이 소실되는 것으로 알려진 TGF-$\beta$계에서는 TGF-$\beta$1이 고농도의 BPA투여시 발현되었지만, 그 외의 리간드와 수용체의 발현은 관찰되지 못했다. 결론적으로 고농도의 BPA노출은 웅성생식계에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 정자형성에 장애를 일으켜 불임을 유발할 수도 있을 것으로 보여진다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제4권1호
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• pp.95-100
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• 2000

환경에 방출되어 있는 많은 내분비교란물질들은 사람과 동물의 내분비계에 교란을 일으킬 수 있는 잠재력을 가진다. 뇌의 성분화는 생식소 호르몬 영향하에 비가역적으로 진행되며 흰쥐의 경우 이 시기는 임신말기에서 생후 7∼10일 가량이다. 최근에 본 연구진은 횐쥐의 뇌 성 분화의 결정적인 시기에 발현되는 KAP3유전자를 클로닝하였다 (Choi ＆ Lee, 1999). KAP3의 기능은 신경세포를 포함한 세포에서 aronal tansport를 조절하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 흰쥐 뇌 발생의 결정적인 시기에 내분비 교란물질인 Dichlorodiphenyl trichloroethane (DDT)가 KAP3유전자 발현과 성분화에 미치는 영향을 검토하였다. DDT에 노출된 임신 17일된 흰쥐 태아 암컷과 수컷의 뇌에서 KAP3 mRNA의 발현이 증가하였다. 그러나 출생후 DDT에 노출된 흰쥐 암컷과 수컷의 뇌에서는 KAP3 mRNA의 발현은 감소하였다. 또한 태어난 직후 DDT에 노출된 경우 체중이 현저히 감소하였으며 수정율도 DDT에 노출되지 않은 흰쥐에 비하여 크게 낮았다. 이러한 결과는 내분비 교란물질인 DDT가 뇌의 성 분화와 관련된 유전자인 KAP3의 전사에 영향을 미치며, 내분비 교란물질에 노출된 태아의 뇌 분화에서 독성을 보이는 것을 의미한다. 그리고 KAP3유전자는 동물의 신경세포의 발생에 미치는 내분비 교란 물질의 독성을 분자생물학적으로 연구하기 위한 유전자 지표로도 사용 가능하다고 생각된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제11권1호
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• pp.13-20
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• 2007

암컷 포유동물의 노화 과정에서 생식계는 체내 여러 시스템 가운데 가장 먼저 기능 저하가 나타난다. 생식 노화(reproductive aging) 과정 중인 암컷 포유동물은 비록 종 특이성이 있지만 주기성(cyclicity)의 소실과 같은 생식 능력의 감소와 함께 여러 기능들의 변화가 동반되면서 궁극적으로 인간의 폐경 현상과 같은 생식 능력 상실이 나타난다. 본 증설은 암컷 포유동물의 생식호르몬 축, 특히 신경내분비 회로의 노화에 대한 정보들과 노화 연구에 유용한 설치류 모델들을 소개하고자 한다. 암컷 설치류의 중년(middle age, 생후 $8{\sim}12$개월)은 인간의 폐경기 진입 직전에 해당되는 시기로, 이 시기에 시상하부 GnRH 분비의 맥동성과 급등(surge)이 현저히 지연되기 시작하고, 곧 이어 뇌하수체 LH 분비의 맥동성과 급등이 역시 약화 내지 지연된다. 노화와 관련된 GnRH-LH 신경내분비 활성의 결손은 시상하부 GnRH 뉴런의 활성을 조절하는 여러 자극(예, glutamate)들의 변화와 밀접하게 연관되어 있다. 많은 연구자들이 이러한 '시상하부 결손(hypothalamic defects)'이 생식 노화의 주된 요인임을 지지하지만, inhibin과 같은 난소 요인의 변화 역시 생식 노화의 유도와 관련된 것으로 보인다. 생식 노화를 연구함에 유용한 몇몇 설치류 모델이 있다; FSH 수용체 녹아웃(follitropin receptor knockout; FORKO) 생쥐 모델의 경우는 homozygous(null) 뿐만 아니라 heterozygous(haploinsufficient) 상태도 노화에 따른 난자/난포의 고갈을 나타낸다. Dioxin/aryl hydrocarbon 수용체 녹아웃 (AhRKO) 생쥐 모델도 유사한 상태를 유발할 수 있다. 생식 노화의 기작에 관한 연구는 삶의 질을 높이기 위한 수단들, 예를 들어 호르몬 보충요법(HRT)의 장단점을 평가하고 안전성을 제고하는데 도움이 될 것이다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제11권2호
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• pp.97-104
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• 2007

본 연구는 광학현미경과 전자현미경을 이용하여 소라, Batillus cornutus의 정자형성과정과 정자의 미세구조를 관찰하였다. 소라는 2003년 5월에 전라남도 완도군 연안에서 잠수하여 채집하였다. 실험개체의 크기는 각고 $60.0{\sim}69.9\;mm$였다. 소라의 정소는 다수의 정자형성소낭으로 구성되며, 이들 소낭 내에는 다양한 발달단계를 가지는 생식세포들이 존재하였다. 태사기의 제 1정모세포에서는 연접사복합체가 관찰되었다. 초기의 정세포에서는 골지체의 출현, 핵질 전자밀도의 증가 및 관상의 미토콘드리아가 확인되었다. 초기 정세포에서 관찰되는 아첨체과립은 전자밀도가 높은 작은 이형과립들로 구성되어 있었다. 정자변태과정의 중기부터는 핵의 후방에서 중심립이 확인되며, 이들 중심립을 중심으로 잘 발달되어진 미토콘드리아들이 위치하고 있었다. 이 시기에 아첨체과립은 응축되며, 얇은 막을 가진 첨체를 형성한다. 후기 정자변태과정 동안에 첨체는 길게 신장되어 원뿔모양으로 변화한다. 정자는 두부, 중편, 미부로 구성된다. 정자의 두부는 원형의 핵과 원뿔모양의 첨체로 구성되며, 미세섬유로 구성된 첨체기둥이 핵과 첨체 사이에 존재하고 있었다. 중편에는 5개의 미토콘드리아가 존재하고 있었다. 정자의 꼬리는 중심립에서 유래된 미세소관의 전형적인 "9+2" 구조를 하고 있었다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제34권3호
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• pp.135-141
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• 2010

Embryoid bodies (EBs) generated from human embryonic stem cells (hESCs) include spontaneously induced endodermal lineage cells (ELCs). Activin-A plays important roles in the endoderm differentiation of hESCs. Despite studies on the generation of ELCs from hESCs with treatment of Actvin-A, it was unclear for localization and pattern of ELCs by Activin-A during differentiation of hESCs. Accordingly in this study, we knew that Actvin-A increased the cystic EBs formation, including the highly enriched AFP (endoderm lineage specific marker)-expressing cells in the surface of cystic EBs. To induce the EBs formation from undifferentiated hESCs, cells were transferred onto petri-dish and cultured in suspension condition without bFGF removed hESC media (EB media) for 3 days. Next to investigate the effect of Activin-A, EBs were subsequently cultured in EB media supplement with 100 ng/ml Activin-A for 3 days. After 5~7 days of Activin-A treatment, cystic EBs began to appear which increased in numbers reaching ~60% of initially formed EBs over 5 days. Endoderm lineage marker, AFP were highly expressed and specifically localized at the surface region of cystic EBs comparison with normal EBs. We next attached the cystic EBs onto gelatin-coated plates and cultured for 5 days. In the results of real-time PCR and immunocytochemistry analysis, AFP-expressing cells migrated and localized at the outgrowth region of attached cystic EBs. To obtain the AFP-expressing cells of the outgrowth region, we manually isolated by using micro-dissection and cultured them. These cells strongly express AFP over 70% of isolated cells post re-plating. Here, we first showed an expression pattern of specifically localized ELCs by Activin-A during differentiation of hESCs. From this observation, we could highly purified ELCs from undifferentiated hESCs. Taken together, our system will provide a novel and efficient option to generate ELCs from hESCs.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제34권3호
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• pp.143-151
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• 2010

Pluripotency of human embryonic stem cell (hESC) is one of the most valuable ability of hESCs for applying cell therapy field, but also showing side effect, for example teratoma formation. When transplant multipotent stem cell, such as mesnchymal stem cell (MSC) which retains similar differentiation ability, they do not form teratoma in vivo, but there exist limitation of cellular source supply. Accordingly, differentiation of hESC into MSC will be promising cellular source with strong points of both hESC and MSC line. In this study, we described the derivation of MSC like cell population from feeder free cultured hESC (hESC-MSC) using direct differentiation system. Cells population, hESC-MSC and bone marrow derived MSC (BM-MSC) retained similar characteristics in vitro, such as morphology, MSC specific marker expression and differentiation capacity. At the point of differentiation of both cell populations, differentiation rate was slower in hESC-MSC than BM-MSC. As these reason, to verify differentially expressed molecular condition of both cell population which bring out different differentiation rate, we compare the molecular condition of hESC-MSC and BM-MSC using 2-D proteomic analysis tool. In the proteomic analysis, we identified 49 differentially expressed proteins in hESC-MSC and BM-MSC, and they involved in different biological process such as positive regulation of molecular function, biological process, cellular metabolic process, nitrogen compound metabolic process, macromolecule metabolic process, metabolic process, molecular function, and positive regulation of molecular function and regulation of ubiquitin protein ligase activity during mitotic cell cycle, cellular response to stress, and RNA localization. As the related function of differentially expressed proteins, we sought to these proteins were key regulators which contribute to their differentiation rate, developmental process and cell proliferation. Our results suggest that the expressions of these proteins between the hESC-MSC and BM-MSC, could give to us further evidence for hESC differentiation into the mesenchymal stem cell is associated with a differentiation factor. As the initial step to understand fundamental difference of hESC-MSC and BM-MSC, we sought to investigate different protein expression profile. And the grafting of hESC differentiation into MSC and their comparative proteomic analysis will be positively contribute to cell therapy without cellular source limitation, also with exact background of their molecular condition.

• 한국근적외분광분석학회:학술대회논문집
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• 한국근적외분광분석학회 2001년도 NIR-2001
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• pp.1273-1273
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• 2001

The efficiency of the luminal fermentation process influences overall efficiency of luminal production, animal health and reproduction. Ruminant production systems have a significant impact on the global environment, as well. Animal wastes contribute to pollution of the environment as ammonia volatilized to the air and nitrate leached to ground water. Microbial protein synthesis in the rumen satisfies a large proportion of the protein requirements of animals. Quantifying the microbial synthesis is possible by using markers for lumen bacteria and protozoa such as nucleic acids, purine bases, some specific amino acids, or by isotopic $^{15}N,^{32}P,\;and\;^{35}S$ labelled feeds. All those methods require cannulated animals, they are time-consuming and some methods are very expensive as well. Many attempts have been made to find an alternative method for indirect measurement of microbial synthesis in intact animals. The present investigations aimed to assess possibilities of NIRS for prediction of purine nitrogen excretion and ruminal microbial nitrogen synthesis by NIR spectra of urine. Urine samples were collected from 12 growing sheep,6 of them male, and 6- female. The sheep were included in feeding experiment. The ration consisted of sorghum silage and protein supplements -70:30 on dry matter basis. The protein supplements were chosen to differ in protein degradability. The urine samples were collected daily in a vessel containing $60m{\ell}$ 10% sulphuric acid to reduce pH below 3 and diluted with tap water to 4 liters. Samples were stored in plastic bottles and frozen at $-20^{\circ}C$ until chemical and NIRS analysis. The urine samples were analyzed for purine derivates - allantoin, uric acid, xantine and hypoxantine content. Microbial nitrogen synthesis in the lumen was calculated according to Chen and Gomes, 1995. Transmittance urine spectra with sample thickness 1mm were obtained by NIR System 6500 spectrophotometer in the spectral range 1100-2500nm. The calibration was performed using ISI software and PLS regression, respectively. The following statistical results of NIRS calibration for prediction of purine derivatives and microbial protein synthesis were obtained.(Table Omitted). The result of estimation of purine nitrogen excretion and microbial protein synthesis by NIR spectra of urine showed accuracy, adequate for rapid evaluation of microbial protein synthesis for a large number of animals and different diets. The results indicate that the advantages of the NIRS technology can be extended into animal physiological studies. The fast and low cost NIRS analyses could be used with no significant loss of accuracy when microbial protein synthesis in the lumen and the microbial protein flow in the duodenum are to be assessed by NIRS.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제35권1호
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• pp.9-15
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• 2011

The functional cardiovascular system is comprised of distinct mesoderm-derived lineages including endothelial cells, vascular smooth muscle cells and other mesenchymal cells. Recent studies in the human embryonic stem cell differentiation model have provided evidence indicating that these cell lineages are developed from the common progenitors such as hemangioblasts and cardiovascular progenitor cells. Also, the studies have suggested that these progenitors have a common primordial progenitor, which expresses KDR (human Flk-1, also known as VEGFR2, CD309). We demonstrate here that sustained activation of BMP4 (bone morphogenetic protein 4) in hESC line, CHA15 hESC results in $KDR^+$ mesoderm specific differentiation. To determine whether the $KDR^+$ population derived from hESCs enhances potential to differentiate along multipotential mesodermal lineages than undifferentiated hESCs, we analyzed the development of the mesodermal cell types in human embryonic stem cell differentiation cultures. In embryoid body (EB) differentiation culture conditions, we identified an increased expression of $KDR^+$ population from BMP4-stimulated hESC-derived EBs. After induction with additional growth factors, the $KDR^+$ population sorted from hESCs-derived EBs displays mesenchymal, endothelial and vascular smooth muscle potential in matrix-coated monolayer culture systems. The populations plated in monolayer cultures expressed increased levels of related markers and exhibit a stable/homologous phenotype in culture terms. In conclusion, we demonstrate that the $KDR^+$ population is stably isolated from CHA15 hESC-derived EBs using BMP4 and growth factors, and sorted $KDR^+$ population can be utilized to generate multipotential mesodermal progenitors in vitro, which can be further differentiated into cardiovascular specific cells.