• BMB Reports
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• 제32권3호
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• pp.306-310
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• 1999

The partial cDNA of the MT-c clone encoding snake venom metalloprotease was subcloned and expressed in E. coli. The expressed metalloprotease was purified by affinity chromatography in the presence of urea, and then successfully refolded into its functional form, retaining metalloprotease activity that hydrolyzes fibrinogen. The simple and convenient refolding strategy established in this work was highly efficient in recovering the recombinant enzyme activity. Experimental evidence suggests that the C-terminal amino acid stretch of 16 residues is a critical sequence for proper folding of the metalloprotease domain.

• KSBB Journal
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• 제18권6호
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• pp.500-505
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• 2003

재조합 대장균에서 내포체 형태로 발현시킨 LK68을 생물학적 활성을 가진 native한 단백질로 재생시키기 위해서 PBA 크로마토그래피와 EBA 크로마토그래피를 이용한 고체상 재접힘을 수행하였다. 내포체와 세포파쇄액을 시작물질로 하여 재접힘 공정을 수행하였으며 총 단백질 회수율과 재접힘 수율을 비교한 결과, EBA 공정이 기존의 액상 재접힘이나 PBA를 이용한 재접힘 공정에 비하여 우수함을 확인하였다. 또한 Iysine binding, RP-HPLC, SEC-HPLC, Ellman method 등을 사용하여 분석한 결과 재접힘된 LK68이 native LK68와 동등함을 확인하였다. 본 연구를 통해 EBA 크로마토그래피를 이용한 재접힘 방법은 재접힘 단계의 수율을 향상시킬 뿐 아니라 공정 단계, 시간 등을 감소시켜 공정 성능을 전체적으로 향상시킬 수 있음을 제시하였다.

• KSBB Journal
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• 제18권4호
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• pp.306-311
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• 2003

융합단백질의 절단을 위해 EK를 고정화하여 액상 절단반응과 같은 80％의 절단수율을 얻을 수 있었다. 그리고 니켈 친화칼럼을 이용하여 간단한 정제공정을 구축하였다. 공유결합한 EK의 경우 니켈친화 결합한 EK보다 높은 재접힘 수율을 나타내었고 풀림과 재접힘을 이용하여 효소의 초기 활성을 회복함에 따라서 반복사용을 통한 경제적인 절단공정을 구축할 수 있게 되었다. 그러나 고정화 과정에서 효소의 활성이 감소하는 문제점과 고정화 수율을 높이기 위한 연구가 필요하다.

• KSBB Journal
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• 제17권2호
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• pp.153-157
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• 2002

Poly-Iysine이 tagging된 hEGF와 angiogenin(6L10ESA)의 융합단백질의 고체상 재접힘이 heparin-Sepharose colullln에서 수행되었을 때, untagging 단백질(E5h)의 기존의 액상 재접힘 방법과 비교하여 재접힘 수율은 약 13배 정도 증가하였다. 게다가 poly-Iysine tagging된angiogenin은 heparin에 친화도를 높여주므로 2.5배에서 3배 정도의 흡탁 수율이 증가한다. 재접힘 수율은 고체상 반응으로 인해 높은 재현성을 보였다. 재접힘 공정시간은 대략 8배 단축되었다. 고체상 재전힘된 단백질은 자신의 생물학적 역가를 유지하였다. 따라서 이 연구는 고체상 재접힘 방법이 분자간의 상호작용을 억제하여 응집현상을 현저히 줄였기 때문에 기인한 결과로 생각된다. 따라서 응집으로 인한 재접힘 수율이 낮은 단백질의 재접힘 긍정에 고체상 재접힘 공정을 사용하면 높은 재접힘 수율을 얻을 수 있다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제10권5호
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• pp.632-637
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• 2000

This research was undertaken to restore the biological activity of cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) of Bacillus macerans origin expressed as inclusion bodies in recombinant Escherichia coli. The optimum concentration of urea used as a denaturant was 8 M. The supplementation of 0.5 M urea into a dialysis buffer increased the refolding efficiency by preventing any protein aggregation. The influence of the protein concentration, temperature, and pH were also investigated. The protein concentration was found to be the most important factor in the refolding efficiency. The optimum temperature was 15-$25^{\circ}C$ and the optimum pH was 6.0. The maximum specific activity of the CGTase refolded under the optimum conditions was 92.2 U/mg, corresponding to 72% of the native CGTase. A comparison of the secondary structure between the native and the refolded CGTase showed that the relative ratio of the $\alpha$-helix content in the native to the refolded CGTase was 1:0.82.

• KSBB Journal
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• 제20권5호
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• pp.338-340
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• 2005

변성제 (urea)와 환원제에 의해 완전히 풀린 상태의 lipase도 PEG에 의해 수식되는 것을 관찰하였다. 또한 mPEG-aldehyde로 수식된 mono-PEGylate과 di-PEGylate을 변성제와 환원제를 이용해 unfolding 시킨 후 희석에 의한 재접힘 시킨 결과, lipase에 공유결합된 PEG 분자는 재접힘 수율에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 따라서 내포체 단백질을 대상으로 변성된 상태에서 PEGylation시킨 후 in vitro 재접힘 공정을 통해 PEGylation된 상태의 재생된 단백질을 회수할 수 있는 통합공정의 타당성을 제시하였다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2001년도 추계학술발표대회
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• pp.85-88
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• 2001

hGH 와 GST 절편으로 구성된 융합 단백질의 고정화 UK 칼럼에 의한 절단 반응 후 용출액의 pH를 3.5 로 낮춤으로써 이물질들을 침전시키고 이를 expanded bed chromatography 칼럼에 통과시킨 결과, 이물질들의 제거와 hGH 단량체의 흡착분리가 동시에 이루어겼다 . 흡착된 단량체는 NaCl 에 의해 용출되었으며 이 단계의 수율은 거의 100% 이었다 , 따라서 칼럼에 의한 절단 반응과 산 침전에 의한 이물질 침잔 반응 EBA 에 의한 이물질 제거 및 단량체 회수 반응을 연속적으로 진행할 수 있는 기초를 제시하였다 . 또한 고정화된 UK 는 guanidine HCl(6M)을 이용하여 unfolding 시키고 이를 세척하여 refolding 시킨 결과 20 회의 반복적인 처리 후에도 초기 활성의 약 80% 수준을 유지하였다. 이는 UK 가 공유결합된 상태에서 solid-phase refolding 이 가능하다는 증거이며, 고정화 효소 칼럼의 수영을 크게 향상시켜 경제성을 확보하는 방안으로 이용될 것으로 기대된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제6권4호
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• pp.225-231
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• 1996

The production of recombinant proteins in Escherichia coli often leads to the formation of an intracellular inclusion body. Key process steps that can determine the economics of large-scale protein production from inclusion bodies are fermentation, inclusion body recovery, and protein refolding. Compared with protein refolding and fermentation, inclusion body recovery has received scant research attention. Nevertheless, it can control the final product yield and hence process cost for some products. Optimal separation of inclusion bodies and cell debris can also aid subsequent operations by removing contaminant particulates that foul chromatographic resins and contain antigenic pyrogens. In this review, the properties of inclusion bodies and cellular debris are therefore examined. Attempts to optimise the centrifugal separation of inclusion bodies and debris are also discussed.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제26권4호
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• pp.365-368
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• 1998

The aklavinone 11-hydroxylase which was overexpressed using T7 promoter in E. coli could be detected in SDS-PAGE only in insoluble precipitate without any detectable enzyme activity. The insoluble enzyme was solubilized in 6M guanidine$.$HCl solution and their refolding ability was tested under various conditions. When the enzymatic activity was checked by the bioconversion experiment, stepwise dialysis against 6M, 3M, 1M guanidine$.$HCl and finally 100 mM potassium phosphate buffer of the solubilized protein gave the best bioconversion efficiency. The aklavinone 11-hydroxylase showed its enzymatic activity in the reaction buffer containing NADPH with vigorous shaking. The enzymatic activity was lost during partial purification and regained by the addition of crude extract of S. lividans in the reaction mixture. This effect was confirmed to due to some low-molecular weight component(s) in the crude extract, because the addition of dialyzed crude extract could not recover the enzymatic activity.

• Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE
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• 제6권4호
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• pp.237-243
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• 2001

Substantial progress has been made towards understanding the folding mechanisms of proteins in virto and in vivo even though the general rules governing such folding events remain unknown. This paper reviews current folding models along with experimental approaches used to elucidate the folding pathways. Protein misfolding is discussed in relation to disease states, such as amyloidosis, and the recent findings on the mechanism of converting normally soluble proteins into amyloid fibrils through the formation of intermediates provide an insight into understanding the pathogenesis of amyloid formation and possible cules for the development of therapeutic treatments. Finally, some commonly adopted refolding strategies developed over the part decade are summarized.