Lee, Jun Beom;Bae, Sung Min;Shin, Tae Young;Woo, Soo Dong
International Journal of Industrial Entomology and Biomaterials
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제30권2호
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pp.50-57
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2015
Porcine circovirus type 2 (PCV2) is an important infectious swine virus causing postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). PCV2 capsid protein, encoded by ORF2 has type-specific epitopes, is very immunogenic, and is associated with the induction of neutralizing antibodies. For the efficient production of capsid protein, recombinant Autographa californica nucleopolyhedroviruses were generated to express ORF2 fused with two forms of a partial polyhedrin. Recombinant capsid protein was produced successfully with the partial polyhedrin fusion form and the yield was high, as was shown by SDS-PAGE. Production of recombinant capsid proteins in insect cells was confirmed by Western blot analysis using anti-His monoclonal antibody, anti-ORF2 monoclonal antibody, and anti-PCV2 porcine serum. Fusion expression with amino acids 19 to 110 of the polyhedrin increased the production of recombinant capsid protein, but fusion with amino acids 32 to 85 did not. Additionally, PCV2 capsid protein is a glycoprotein; however, the glycosylation of recombinant protein was not observed. The results of an Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) showed that recombinant capsid proteins could be utilized as antigens for fast, large-scale diagnosis of PCV2-infected pigs. Our results suggest that the fusion expression of partial polyhedrin is able to increase the production of recombinant PCV2 capsid protein in insect cells.
Li, Ning;Yang, Peilong;Wang, Yaru;Luo, Huiying;Meng, Kun;Wu, Nigfeng;Fan, Yunliu;Yao, Bin
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제18권3호
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pp.410-416
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2008
The gene SfXyn10, which encodes a protease-resistant xylanase, was isolated using colony PCR screening from a genomic library of a feather-degrading bacterial strain Streptomyces fradiae var. k11. The full-length gene consists of 1,437bp and encodes 479 amino acids, which includes 41 residues of a putative signal peptide at its N terminus. The amino acid sequence shares the highest similarity (80%) to the endo-1,4-${\beta}$-xylanase from Streptomyces coelicolor A3, which belongs to the glycoside hydrolase family 10. The gene fragment encoding the mature xylanase was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The recombinant protein was purified to homogeneity by acetone precipitation and anion-exchange chromatography, and subsequently characterized. The optimal pH and temperature for the purified recombinant enzyme were 7.8 and $60^{\circ}C$, respectively. The enzyme showed stability over a pH range of 4.0-10.0. The kinetic values on oat spelt xylan and birchwood xylan substrates were also determined. The enzyme activity was enhanced by $Fe^{2+}$ and strongly inhibited by $Hg^{2+}$ and SDS. The enzyme also showed resistance to neutral and alkaline proteases. Therefore, these characteristics suggest that SfXyn10 could be an important candidate for protease-resistant mechanistic research and has potential applications in the food industry, cotton scouring, and improving animal nutrition.
Kim, Chung-Sei;Hong, Chang-Ki;Kim, Kyoung-Yun;Wang, Xiu-Ling;Kang, Su-Il;Kim, Su-Il
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제17권1호
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pp.37-43
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2007
A gene encoding inulin fructotransferase (di-D-fructofuranose 1,2': 2,3' dianhydride [DFA III]-producing IFTase, EC 4.2.2.18) from Bacillus sp. snu-7 was cloned. This gene was composed of a single, 1,353-bp open reading frame encoding a protein composed of a 40-amino acid signal peptide and a 410-amino acid mature protein. The deduced amino acid sequence was 98% identical to Arthrobacter globiformis C11-1 IFTase (DFA III-producing). The enzyme was successfully expressed in E. coli as a functionally active, His-tagged protein, and it was purified in a single step using immobilized metal affinity chromatography. The purified enzyme showed much higher specific activity (1,276 units/mg protein) than other DFA III-producing IFTases. The recombinant and native enzymes were optimally active in very similar pH and temperature conditions. With a 103-min half-life at $60^{\circ}C$, the recombinant enzyme was as stable as the native enzyme. Acidic residues and cysteines potentially involved in the catalytic mechanism are proposed based on an alignment with other IFTases and a DFA IIIase.
Human insulin is composed of 21 amino acids of an A-chain and 30 amino acids of a B-chain. This is the protein hormone that has the role of blood sugar control. When the recombinant human proinsulin is expressed in Escherichia coli, a serious problem is the formation of an inclusion body. Therefore, the inclusion body must be denatured and refolded under chaotropic agents and suitable reductants. In this study, H27R-proinsulin was refolded from the denatured form with β-mercaptoethanol and urea. The refolding reaction was completed after 15 h at $15^{\circ}C$, whereas the reaction at $25^{\circ}C$ was faster than that at $15^{\circ}C$. The refolding yield at $15^{\circ}C$ was 17% higher than that at $25^{\circ}C$. The refolding reaction could be carried out at a high protein concentration (2 g/l) using direct refolding without sulfonation. The most economical and optimal refolding condition for human preproinsulin was 1.5 g/l protein, 10 mM glycine buffer containing 0.6 M urea, pH 10.6, and 0.3 mM β-mercaptoethanol at $15^{\circ}C$ for 16 h. The maximum refolding yield was 74.8% at $15^{\circ}C$ with 1.5 g/l protein. Moreover, the refolded preproinsulin could be converted into normal mature insulin with two enzymes. The average amount of human insulin was 138.2 g from 200 L of fermentation broth after enzyme reaction with H27R-proinsulin. The direct refolding process for H27R-proinsulin was successfully set up without sulfonation. The step yields for refolding and enzyme reaction were comparatively high. Therefore, our refolding process for production of recombinant insulin may be beneficial to the large-scale production of other biologically active proteins.
A psychrotrophic strain 7195 showing extracellular lipolytic activity towards tributyrin was isolated from deep-sea sediment of Prydz Bay and identified as a Psychrobacter species. By screening a genomic DNA library of Psychrobacter sp. 7195, an open reading frame of 954 bp coding for a lipase gene, lipA1, was identified, cloned, and sequenced. The deduced LipA1 consisted of 317 amino acids with a molecular mass of 35,210 kDa. It had one consensus motif, G-N-S-M-G (GXSXG), containing the putative active-site serine, which was conserved in other cold-adapted lipolytic enzymes. The recombinant LipA1 was purified by column chromatography with DEAE Sepharose CL-4B, and Sephadex G-75, and preparative polyacrylamide gel electrophoresis, in sequence. The purified enzyme showed highest activity at $30^{\circ}C$, and was unstable at temperatures higher than $30^{\circ}C$, indicating that it was a typical cold-adapted enzyme. The optimal pH for activity was 9.0, and the enzyme was stable between pH 7.0-10.0 after 24h incubation at $4^{\circ}C$. The addition of $Ca^{2+}\;and\;Mg^{2+}$ enhanced the enzyme activity of LipA1, whereas the $Cd^{2+},\;Zn^{2+},\;CO^{2+},\;Fe^{3+},\;Hg^{2+},\;Fe^{2+},\;Rb^{2+}$, and EDTA strongly inhibited the activity. The LipA1 was activated by various detergents, such as Triton X-100, Tween 80, Tween 40, Span 60, Span 40, CHAPS, and SDS, and showed better resistance towards them. Substrate specificity analysis showed that there was a preference for trimyristin and p-nitrophenyl myristate $(C_{14}\;acyl\; groups)$.
융합단백질의 절단을 위해 EK를 고정화하여 액상 절단반응과 같은 80%의 절단수율을 얻을 수 있었다. 그리고 니켈 친화칼럼을 이용하여 간단한 정제공정을 구축하였다. 공유결합한 EK의 경우 니켈친화 결합한 EK보다 높은 재접힘 수율을 나타내었고 풀림과 재접힘을 이용하여 효소의 초기 활성을 회복함에 따라서 반복사용을 통한 경제적인 절단공정을 구축할 수 있게 되었다. 그러나 고정화 과정에서 효소의 활성이 감소하는 문제점과 고정화 수율을 높이기 위한 연구가 필요하다.
Indole-3-acetic acid (IAA) is produced commonly by plants and many bacteria, however, little is known about the genetic basis involving the key enzymes of IAA biosynthetic pathways from Bacillus spp. IAA intermediates from the Gram-positive spore-forming bacterium Paenibacillus polymyxa E681 were investigated, which showed the existence of only an indole-3-pyruvic acid (IPA) pathway for IAA biosynthesis from the bacterium. Four open reading frames (ORFs) encoding indole-3-pyruvate decarboxylase-like proteins and putative indole-3-pyruvate decarboxylase (IPDC), a key enzyme in the IPA synthetic pathway, were found on the genome sequence database of P. polymyxa and cloned in Escherichia coli DH5$\alpha$. One of the ORFs, PP2_01257, was assigned as probable indole-3-pyruvate decarboxylase. The ORF consisted of 1,743 nucleotides encoding 581 amino acids with a deduced molecular mass of 63,380 Da. Alignment studies of the deduced amino acid sequence of the ORF with known IPDC sequences revealed conservation of several amino acids in PP2_01257, essential for substrate and cofactor binding. Recombinant protein, gene product of the ORF PP2_01257 from P. polymyxa E681, was expressed in E. coli BL21 (DE3) as a glutathione S-transferase (GST)-fusion protein and purified to homogeneity using affinity chromatography. The molecular mass of the purified enzyme showed about 63 kDa, corresponding closely to the expected molecular mass of IPDC. The indole-3-pyruvate decarboxylase activity of the recombinant protein, detected by HPLC, using IPA substrate in the enzyme reaction confirmed the identity and functionality of the enzyme IPDC from the E681 strain.
In order to express recombinant porcine TGF-${\beta}1$ protein in a baculovirus expression system the entire TGF-${\beta}1$gene containing extra amino acids at the N terminus was cloned into pFBa and pFBb of the Bac-To-$Bac^{TM}$ baculovirus expression system. One of the clones contained 106 extra amino acids and was designated pFBa-106 TGF-${\beta}1$, and the other had 28 extra amino acids and was designated pFBb-28 TGF-${\beta}1$. The orientation of the gene was identified with restriction enzyme mapping and PCR with internal TGF-${\beta}1$ primers. Sf-9 cells were infected at a m.o.i. of 10 by the recombinant viruses generated from the two expected sizes of 55 kD and 46.4kD. these precursor forms of TGF-${\beta}1$ with a polyclonal antibody against human TGF-${\beta}1$. No mature form of TGF-${\beta}1$ protein was detected on SDS gels and an immunoblot indicated that TGF-${\beta}1$ precursor is not properlu processed in insect cells.
Acetolactate synthase (ALS) is the first common enzyme in the biosynthesis of L-Ieucine, L-isoleucine, and L-valine. The sulfonylurea-resistant ALS gene from Nicotiana tabacum was cloned into the bacterial expression vector pGEX-2T. The resulting recombinant plasmid pGEX-ALS3 was used to transform Escherichia coli strain XL1-Blue, and the mutant tobacco ALS (mALS) was expressed in the bacteria as a protein fused with glutathione S-transferase (GST). The fusion product GST-mALS was purified in a single step on a glutathione-Sepharose column. ALS activities of 0.9-2.5 ${\mu}mol/min/mg$ protein were observed in the GST-mALS, and the Km values for pyruvate, FAD, and TPP were 10.8-24.1, $(1.9-8.9){\times}10^{-3}$, and 0.14-0.38 mM, respectively. The purified GST-mALS was resistant to both the sulfonylurea and the triazolopyrimidine herbicides, and lost its sensitivity to end products, L-valine and L-leucine. For comparision, the tobacco wild-type recombinant ALS fused with GST, GST-wALS, was also characterized with respect to its pyruvate and cofactor bindings. These results suggest that the purified mutant recombinant tobacco ALS was functionally active, that the mutations resulting in herbicide resistance has affected pyruvate and cofactor bindings," and that the two classes of herbicides interact at a common site on the plant ALS.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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