싸이토카인은 염증 및 면역 반응의 평가에 있어서 매우 중요한 요소이다. 따라서 이들의 mRNA 수준을 정량하고 평가하는 것은 염증 및 면역 반응을 평가하는데 있어서 그 민감도가 매우 높은 방법으로 알려져 있다. 본 연구의 목적은 SYBR green dye를 이용하여 개의 싸이토카인 mRNA를 정량적 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time reverse transcriptase PCR; qRT-PCR)으로 분석을 할 수 있도록 함에 있다고 할 수 있다. 제작된 시발체(primer)의 최적화된 붙임 온도(annealing temperature; $T_a$)는 인터루킨(interleukin; IL)-$1{\beta}$, IL-6, IL-10이 각각 $62^{\circ}C$, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)와 tumor necrosis factor (TNF)-${\alpha}$가 $60^{\circ}C$ 그리고 high mobility group box 1 (HMGB1)이 $58^{\circ}C$였다. 표준 정량 곡선을 이용하여 측정한 시발체의 효율성은 97.1%에서 102.%로 매우 높았고, 2차 구조물(secondary structure)과 시발체-이합체 형성(primer-dimer formation)은 융해곡선(melt-curve)분석과 전기영동을 통해 확인하였다. 이렇게 정립된 qRT-PCR 분석법은 민감도와 특이도가 매우 높은 개 싸이토카인 유전자 정량법으로 활용될 수 있을 것이다.
Cell cycle progression is regulated by both transcriptional and post-transcriptional mechanisms. MicroRNAs (miRNAs) emerge as a new class of small non-coding RNA regulators of cell cycle as recent evidence suggests. It is hypothesized that expression of specific miRNAs oscillates orderly along with cell cycle progression. However, the oscillated expression patterns of many candidate miRNAs have yet to be determined. Here, we describe miRNA expression profiling in double-thymidine synchronized HeLa cells as cell cycle progresses. Twenty-five differentially expressed miRNAs were classified into five groups based on their cell cycle-dependent expression patterns. The cyclic expression of six miRNAs (miR-221, let-7a, miR-21, miR-34a, miR-24, miR-376b) was validated by real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR). These results suggest that specific miRNAs, along with other key factors are required for maintaining and regulating proper cell cycle progression. The study deepens our understanding on cell cycle regulation.
Kim, Do-Kyung;Kim, Chun-Sung;Kim, Heung-Joong;Kook, Joong-Ki;Kim, Seung-Hee;Lee, Baek-Hee;Lee, Yun-Ho;Mo, Shin-Yeob;Loh, Horace H.
International Journal of Oral Biology
/
제35권2호
/
pp.69-74
/
2010
The mu opioid receptor (MOR) has been regarded as the main site of interaction with analgesics in major clinical use, particularly morphine. The repressor element-1 silencing transcription factor (REST) functions as a transcriptional repressor of neuronal genes in non-neuronal cells. However, it is expressed in certain mature neurons, suggesting that it may have complex and novel roles. In addition, the interactions between MOR and REST and their functions remain unclear. In this study, we examined the effects of morphine on the expression of REST mRNA and protein in human neuroblastoma NMB cells to investigate the roles of REST induced by MOR activation in neuronal cells. To determine the effects of morphine on REST expression, we performed RT-PCR, real-time quantitative RT-PCR, western blot analysis and radioligand binding assays in NMB cells. By RTPCR and real-time quantitative RT-PCR, the expression of REST was found to be unchanged by either the MOR agonist morphine or the MOR specific antagonist CTOP. By western blot, morphine was shown to significantly inhibit the expression of REST, but this suppression was completely blocked by treatment with CTOP. In the radioligand binding assay, the overexpression of REST led to an increased opioid ligand binding activity of endogenous MOR in the NMB cells. These results together suggest that morphine inhibits the expression of REST in human neuroblastoma cells through a post-transcriptional regulatory mechanism mediated through MOR.
Real-time quantitative PCR (qRT-PCR) is one of the important methods for investigating the changes in mRNA expression levels in cells and tissues. Selection of the proper reference genes is very important when calibrating the results of real-time quantitative PCR. Studies on the selection of reference genes in goat tissues are limited, despite the economic importance of their meat and dairy products. We used real-time quantitative PCR to detect the expression levels of eight reference gene candidates (18S, TBP, HMBS, YWHAZ, ACTB, HPRT1, GAPDH and EEF1A2) in ten tissues types sourced from Boer goats. The optimal reference gene combination was selected according to the results determined by geNorm, NormFinder and Bestkeeper software packages. The analyses showed that tissue is an important variability factor in genes expression stability. When all tissues were considered, 18S, TBP and HMBS is the optimal reference combination for calibrating quantitative PCR analysis of gene expression from goat tissues. Dividing data set by tissues, ACTB was the most stable in stomach, small intestine and ovary, 18S in heart and spleen, HMBS in uterus and lung, TBP in liver, HPRT1 in kidney and GAPDH in muscle. Overall, this study provided valuable information about the goat reference genes that can be used in order to perform a proper normalisation when relative quantification by qRT-PCR studies is undertaken.
In this study, a new triplex real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (tqRT-PCR) assay was developed for the rapid and differential detection of three feline viral pathogens including feline calicivirus (FCV), feline herpesvirus 1 (FHV-1), and influenza A virus (IAV) in a single reaction. The assay specifically amplified three targeted viral genes with a detection limit of below 10 copies/reaction. The assay showed high repeatability and reproducibility, with intra- and inter-assay coefficients of variation of less than 1%. Based on the diagnostic results of the assay using 120 clinical samples obtained from cats with feline respiratory disease complex (FRDC)-suspected signs, the prevalence of FCV, FHV-1, or IAV was 43.3%, 22.5%, or 0%, respectively, indicating that the diagnostic sensitivity was comparable or superior to those of previously reported monoplex qRT-PCR/qPCR assays. The dual infection rate for FCV and FHV-1 was 8.3%. These results indicate that FCV and FHV-1 are widespread and that co-infection with FCV and FHV-1 frequently occur in the Korean cat population. The developed tqRT-PCR assay will serve as a promising tool for etiological and epidemiological studies of these three bacterial pathogens, and the prevalence data for three feline viruses obtained in this study will contribute to expanding knowledge about the epidemiology of FRDC in the current Korean cat population.
Techniques to evaluate gene expression profiling, such as sufficiently sensitive cDNA microarrays or real-time quantitative PCR, are efficient methods for monitoring human pluripotent stem cell (hESC/iPSC) cultures. However, most of these high-throughput tests have a limited use due to high cost, extended turn-around time, and the involvement of highly specialized technical expertise. Hence, there is an urgency of rapid, cost-effective, robust, yet sensitive method development for routine screening of hESCs/hiPSCs. A critical requirement in hESC/hiPSC cultures is to maintain a uniform undifferentiated state and to determine their differentiation capacity by showing the expression of gene markers representing all three germ layers, including ectoderm, mesoderm, and endoderm. To quantify the modulation of gene expression in hESCs/hiPSC during their propagation, expansion, and differentiation via embryoid body (EB) formation, we developed a simple, rapid, inexpensive, and definitive multimarker, semiquantitative multiplex RT-PCR platform technology. Among the 9 gene primers tested, 5 were pluripotent markers comprising set 1, and 3 lineage-specific markers were combined as set 2, respectively. We found that these 2 sets were not only effective in determining the relative differentiation in hESCs/hiPSCs, but were easily reproducible. In this study, we used the hES/hiPS cell lines to standardize the technique. This multiplex RT-PCR assay is flexible and, by selecting appropriate reporter genes, can be designed for characterization of different hESC/hiPSC lines during routine maintenance and directed differentiation.
Real time reverse transcription (RT)-PCR was used to quantify the expression of the botulinum neurotoxin type A (BoNT/A) gene (cntA) by normalization with the expression of 16S rRNA. The method were confirmed by monitoring the mRNA levels of cntA during growth in five type A strains. In all but one of the strains the expression of cntA mRNA was maximal in the late exponential phase, and approximately 35-fold greater than in the early exponential phase. The concentration of the extracellular BoNT/A complex detected by ELISA was highest in stationary phase. Sodium nitrite and sorbic acid completely inhibited growth at 20 ppm and $4mg\;ml^{-1}$, respectively. CntA expression became lower in proportion to the concentration of sorbic acid, and this reduction was confirmed by mouse bioassay. Our results show that real time RT-PCR can be used to quantify levels of C. botulinum type A neurotoxin transcripts and to assess the effects of food additives on botulinal risk.
Outbreaks of food poisoning due to the consumption of norovirus-contaminated shellfish continue to occur. Male-specific (F+) coliphage has been suggested as an indicator of viral species due to the association with animal and human wastes. Here, we compared two methods, the double agar overlay and the quantitative real-time PCR (RT-PCR)-based method, for evaluating the applicability of F+ coliphage-based detection technique in microbial contamination tracking of shellfish samples. The RT-PCR-based method showed 1.6-39 times higher coliphage PFU values from spiked shellfish samples, in relation to the double agar overlay method. These differences indicated that the RT-PCR-based technique can detect both intact viruses and non-particle-protected viral DNA/RNA, suggesting that the RT-PCR based method could be a more efficient tool for tracking microbial contamination in shellfish. However, the virome information on F+ coliphage-contaminated oyster samples revealed that the high specificity of the RT-PCR- based method has a limitation in microbial contamination tracking due to the genomic diversity of F+ coliphages. Further research on the development of appropriate primer sets for microbial contamination tracking is therefore necessary. This study provides preliminary insight that should be examined in the search for suitable microbial contamination tracking methods to control the sanitation of shellfish and related seawater.
A one-step real-time quantitative RT-PCR assay in combination with automated RNA extraction was evaluated for routine testing of HCV RNA in the laboratory. Specific primers and probes were developed to detect 302 bp on 5'-UTR of HCV RNA. The assay was able to quantitate a dynamic linear range of $10^7-10^1$ HCV RNA copies/reaction ($R^2=0.997$). The synthetic HCV RNA standard of $1.84{\pm}0.1\;(mean{\pm}SD)$ copies developed in this study corresponded to 1 international unit (IU) of WHO International Standard for HCV RNA (96/790 I). The detection limit of the assay was 3 RNA copies/reaction (81 IU/ml) in plasma samples. The assay was comparable to the Amplicor HCV Monitor (Monitor) assay with correlation coefficient r=0.985, but was more sensitive than the Monitor assay. The assay could be completed within 3 h from RNA extraction to detection and data analysis for up to 32 samples. It allowed rapid RNA extraction, detection, and quantitation of HCV RNA in plasma samples. The method provided sufficient sensitivity and reproducibility and proved to be fast and labor-saving, so that it was suitable for high throughput HCV RNA test.
Chromosomal rearrangements are major pathology in hematological malignancies. The detection of minimal residual disease (MRD) for these gene rearrangements helps in monitoring treatment outcomes and predicting prognosis of patients. Recently, quantification of these gene transcripts based on real-time quantitative polymerase chain reaction (RQ-PCR) has been used as MRD detection. The purpose of this study is to ensure the usefulness of the RQ-PCR technique for detecting MRD in hamatological malignancy patients. The patients had been diagnosed to AML1-ETO positive AML, PML-RARa positive AML and BCR-ABL positive MPN at Chonnam National University Hwasun Hospital from Jan. 2006 to Aug. 2008. The fusion transcript was quntified by RQ-PCR and analyzed in comparison to conventional cytogenetics, FISH and RT-PCR. The fusion gene transcript was quantified by RQ-PCR in 57 samples from 14 patients with AML1-ETO positive AML, 79 samples from 27 patients with PML-RARa positive AML and 108 samples from 36 patients with CML. At diagnosis, the quantitative fusion transcripts for AM1-ETO, PML-RARa and BCR-ABL showed the range of 0.485552651~10.82233683 (mean 3.782217131, SD 2.998052348), 0.005300395~0.29267494 (mean 0.056901315, SD 0.080131381) and 0.1293929~12.94826849 (mean 1.701935665, SD 2.200913158). The increase of AML1-ETO fusion gene transcripts preceded morphologic relapse in two patients. Quantification of fusion gene transcripts by RQ-PCR could detected MRD in samples which were negative by in cytogenetic analysis or FISH. Our findings indicated that quantitative analysis of AML1-ETO, PML-RARa and BCR-ABL transcripts by RQ-PCR might be a useful tool for the monitoring of minimal residual disease in hematological malignancies.
본 웹사이트에 게시된 이메일 주소가 전자우편 수집 프로그램이나
그 밖의 기술적 장치를 이용하여 무단으로 수집되는 것을 거부하며,
이를 위반시 정보통신망법에 의해 형사 처벌됨을 유념하시기 바랍니다.
[게시일 2004년 10월 1일]
이용약관
제 1 장 총칙
제 1 조 (목적)
이 이용약관은 KoreaScience 홈페이지(이하 “당 사이트”)에서 제공하는 인터넷 서비스(이하 '서비스')의 가입조건 및 이용에 관한 제반 사항과 기타 필요한 사항을 구체적으로 규정함을 목적으로 합니다.
제 2 조 (용어의 정의)
① "이용자"라 함은 당 사이트에 접속하여 이 약관에 따라 당 사이트가 제공하는 서비스를 받는 회원 및 비회원을
말합니다.
② "회원"이라 함은 서비스를 이용하기 위하여 당 사이트에 개인정보를 제공하여 아이디(ID)와 비밀번호를 부여
받은 자를 말합니다.
③ "회원 아이디(ID)"라 함은 회원의 식별 및 서비스 이용을 위하여 자신이 선정한 문자 및 숫자의 조합을
말합니다.
④ "비밀번호(패스워드)"라 함은 회원이 자신의 비밀보호를 위하여 선정한 문자 및 숫자의 조합을 말합니다.
제 3 조 (이용약관의 효력 및 변경)
① 이 약관은 당 사이트에 게시하거나 기타의 방법으로 회원에게 공지함으로써 효력이 발생합니다.
② 당 사이트는 이 약관을 개정할 경우에 적용일자 및 개정사유를 명시하여 현행 약관과 함께 당 사이트의
초기화면에 그 적용일자 7일 이전부터 적용일자 전일까지 공지합니다. 다만, 회원에게 불리하게 약관내용을
변경하는 경우에는 최소한 30일 이상의 사전 유예기간을 두고 공지합니다. 이 경우 당 사이트는 개정 전
내용과 개정 후 내용을 명확하게 비교하여 이용자가 알기 쉽도록 표시합니다.
제 4 조(약관 외 준칙)
① 이 약관은 당 사이트가 제공하는 서비스에 관한 이용안내와 함께 적용됩니다.
② 이 약관에 명시되지 아니한 사항은 관계법령의 규정이 적용됩니다.
제 2 장 이용계약의 체결
제 5 조 (이용계약의 성립 등)
① 이용계약은 이용고객이 당 사이트가 정한 약관에 「동의합니다」를 선택하고, 당 사이트가 정한
온라인신청양식을 작성하여 서비스 이용을 신청한 후, 당 사이트가 이를 승낙함으로써 성립합니다.
② 제1항의 승낙은 당 사이트가 제공하는 과학기술정보검색, 맞춤정보, 서지정보 등 다른 서비스의 이용승낙을
포함합니다.
제 6 조 (회원가입)
서비스를 이용하고자 하는 고객은 당 사이트에서 정한 회원가입양식에 개인정보를 기재하여 가입을 하여야 합니다.
제 7 조 (개인정보의 보호 및 사용)
당 사이트는 관계법령이 정하는 바에 따라 회원 등록정보를 포함한 회원의 개인정보를 보호하기 위해 노력합니다. 회원 개인정보의 보호 및 사용에 대해서는 관련법령 및 당 사이트의 개인정보 보호정책이 적용됩니다.
제 8 조 (이용 신청의 승낙과 제한)
① 당 사이트는 제6조의 규정에 의한 이용신청고객에 대하여 서비스 이용을 승낙합니다.
② 당 사이트는 아래사항에 해당하는 경우에 대해서 승낙하지 아니 합니다.
- 이용계약 신청서의 내용을 허위로 기재한 경우
- 기타 규정한 제반사항을 위반하며 신청하는 경우
제 9 조 (회원 ID 부여 및 변경 등)
① 당 사이트는 이용고객에 대하여 약관에 정하는 바에 따라 자신이 선정한 회원 ID를 부여합니다.
② 회원 ID는 원칙적으로 변경이 불가하며 부득이한 사유로 인하여 변경 하고자 하는 경우에는 해당 ID를
해지하고 재가입해야 합니다.
③ 기타 회원 개인정보 관리 및 변경 등에 관한 사항은 서비스별 안내에 정하는 바에 의합니다.
제 3 장 계약 당사자의 의무
제 10 조 (KISTI의 의무)
① 당 사이트는 이용고객이 희망한 서비스 제공 개시일에 특별한 사정이 없는 한 서비스를 이용할 수 있도록
하여야 합니다.
② 당 사이트는 개인정보 보호를 위해 보안시스템을 구축하며 개인정보 보호정책을 공시하고 준수합니다.
③ 당 사이트는 회원으로부터 제기되는 의견이나 불만이 정당하다고 객관적으로 인정될 경우에는 적절한 절차를
거쳐 즉시 처리하여야 합니다. 다만, 즉시 처리가 곤란한 경우는 회원에게 그 사유와 처리일정을 통보하여야
합니다.
제 11 조 (회원의 의무)
① 이용자는 회원가입 신청 또는 회원정보 변경 시 실명으로 모든 사항을 사실에 근거하여 작성하여야 하며,
허위 또는 타인의 정보를 등록할 경우 일체의 권리를 주장할 수 없습니다.
② 당 사이트가 관계법령 및 개인정보 보호정책에 의거하여 그 책임을 지는 경우를 제외하고 회원에게 부여된
ID의 비밀번호 관리소홀, 부정사용에 의하여 발생하는 모든 결과에 대한 책임은 회원에게 있습니다.
③ 회원은 당 사이트 및 제 3자의 지적 재산권을 침해해서는 안 됩니다.
제 4 장 서비스의 이용
제 12 조 (서비스 이용 시간)
① 서비스 이용은 당 사이트의 업무상 또는 기술상 특별한 지장이 없는 한 연중무휴, 1일 24시간 운영을
원칙으로 합니다. 단, 당 사이트는 시스템 정기점검, 증설 및 교체를 위해 당 사이트가 정한 날이나 시간에
서비스를 일시 중단할 수 있으며, 예정되어 있는 작업으로 인한 서비스 일시중단은 당 사이트 홈페이지를
통해 사전에 공지합니다.
② 당 사이트는 서비스를 특정범위로 분할하여 각 범위별로 이용가능시간을 별도로 지정할 수 있습니다. 다만
이 경우 그 내용을 공지합니다.
제 13 조 (홈페이지 저작권)
① NDSL에서 제공하는 모든 저작물의 저작권은 원저작자에게 있으며, KISTI는 복제/배포/전송권을 확보하고
있습니다.
② NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 상업적 및 기타 영리목적으로 복제/배포/전송할 경우 사전에 KISTI의 허락을
받아야 합니다.
③ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 보도, 비평, 교육, 연구 등을 위하여 정당한 범위 안에서 공정한 관행에
합치되게 인용할 수 있습니다.
④ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 무단 복제, 전송, 배포 기타 저작권법에 위반되는 방법으로 이용할 경우
저작권법 제136조에 따라 5년 이하의 징역 또는 5천만 원 이하의 벌금에 처해질 수 있습니다.
제 14 조 (유료서비스)
① 당 사이트 및 협력기관이 정한 유료서비스(원문복사 등)는 별도로 정해진 바에 따르며, 변경사항은 시행 전에
당 사이트 홈페이지를 통하여 회원에게 공지합니다.
② 유료서비스를 이용하려는 회원은 정해진 요금체계에 따라 요금을 납부해야 합니다.
제 5 장 계약 해지 및 이용 제한
제 15 조 (계약 해지)
회원이 이용계약을 해지하고자 하는 때에는 [가입해지] 메뉴를 이용해 직접 해지해야 합니다.
제 16 조 (서비스 이용제한)
① 당 사이트는 회원이 서비스 이용내용에 있어서 본 약관 제 11조 내용을 위반하거나, 다음 각 호에 해당하는
경우 서비스 이용을 제한할 수 있습니다.
- 2년 이상 서비스를 이용한 적이 없는 경우
- 기타 정상적인 서비스 운영에 방해가 될 경우
② 상기 이용제한 규정에 따라 서비스를 이용하는 회원에게 서비스 이용에 대하여 별도 공지 없이 서비스 이용의
일시정지, 이용계약 해지 할 수 있습니다.
제 17 조 (전자우편주소 수집 금지)
회원은 전자우편주소 추출기 등을 이용하여 전자우편주소를 수집 또는 제3자에게 제공할 수 없습니다.
제 6 장 손해배상 및 기타사항
제 18 조 (손해배상)
당 사이트는 무료로 제공되는 서비스와 관련하여 회원에게 어떠한 손해가 발생하더라도 당 사이트가 고의 또는 과실로 인한 손해발생을 제외하고는 이에 대하여 책임을 부담하지 아니합니다.
제 19 조 (관할 법원)
서비스 이용으로 발생한 분쟁에 대해 소송이 제기되는 경우 민사 소송법상의 관할 법원에 제기합니다.
[부 칙]
1. (시행일) 이 약관은 2016년 9월 5일부터 적용되며, 종전 약관은 본 약관으로 대체되며, 개정된 약관의 적용일 이전 가입자도 개정된 약관의 적용을 받습니다.