Pullulanase (PUL), a debranching enzyme, has been utilized in hydrolyzing the a-1,6 glucosidic linkages in starch, amylopectin, pullulan, as well as related oligosaccharides. It has also been indicated that PUL is a novel indicator of inherent RS (Resistant Starch) formation in rice. In this study, we performed haplotype analysis on 320 bred rice accessions, and additional 54 wild accessions were added to study genetic diversity along with other population-based analyses of the PUL gene. Through these investigations, we summarized a total of 10 functional (non-synonymous) SNPs from 7 different exons on chromosome 4. There were 10 haplotypes, of which only six haplotypes were functional, implicating different subpopulations. Diversity reduction was noticed in temperate japonica (0.0005) compared to the highest one (aus, 0.0154), illustrating their higher genetic differentiation by FST-value (0.926). The highest Tajima^ D value was observed in indica (3.6613), indicating PUL gene domestication signature under balancing selection, while the lowest Tajima's D value was found in temperate japonica (-2.2191) which might have undergone under positive selection and purified due to the excess of rare alleles. PCA, population structure, and phylogenetic analyses provide information on the genetic relatedness between and or among the cultivated subpopulations and the wild based on PUL genomic region.
The effects of cell lytic enzyme treatment on total phenolic content, antioxidant and antityrosinase activities of lotus leaf were investigated. The dried lotus leaves were hydroyzed by cell lytic enzymes such as Promozyme, Ceremix, Pectinex, Ultraflo, Celluclast, Pentopan, Tunicase, Viscozyme at their optimum pHs (pH 5-8) at $50^{\circ}C$ for 4 hrs. Depending on the enzymes used, total phenolic compounds content was measured as $1,079-1,476{\mu}g$/mL, and antioxidant activities and whitening activities were increased by 5~10% and 20%, respectively Among the tested hydrolytic enzymes, Promozyme (pullulanase) was selected as the most suitable enzyme for the extraction of total polyphenol from lotus leaf. The optimal dosage of Promozyme were found to be 1-2% (w/w). By Promozyme treatment, total phenolic compounds content of the lotus extract significantly increased compared to the extraction without enzyme treatment.
Two forms of glucoamylase (GI and GII) from starch-grown Lipomyces kononenkoae CBS 5608 mutant were purified to apparent homogeneity by means of ultrafiltration, Sephacryl S-200 gel filtration and DEAE Sephadex A-50 chromatography. The apparent molecular weight was calculated as ca. 150 kDa for GI and ca. 128 kDa for GII, respectively. Both enzymes were glycoproteins with isoelectric points of 5.6 (GI) and 5.4 (GII). They had a pH optimun of 4.5 and were stable from pH 5 to 8. The temperature optimum for both enzymes was $60^{\circ}C$, but they were rapidly inactivated above $70^{\circ}C$. The $K_m$ values toward starch were estimated to be 6.57 mg per ml for GI and 4.52 mg per ml for GII, and the $V_{max}$ values were 16.28 ${\mu}M$ per mg for GI and 32.25 ${\mu}M$ per mg for GII, respectively. The $K_m$ and $V_{max}$ values of GII for ${\alpha}-$ or ${\beta}-cyclodextrin$ were estimated to be 0.15 mg per ml and 2.0 mg per ml, respectively ($K_m$) and 1.02 ${\mu}M$ per mg or 1.02 ${\mu}M$ per mg, respectively ($V_{max}$). Neither enzyme exhibited pullulanase activity but they released only glucose from starch or cyclodextrin. Amino acid analysis indicated that both glucoamylases were enriched in proline and acid amino acids. Glucoamylase GII strongly cross-reacted with a monoclonal antibody raised against GI enzymes, and the two enzymes shared very similar amino acid composition. Western blot analysis indicated that L. kononenkoae CBS 5608 mutant produced two forms of glucoamylase on starch, and that synthesis of them was subject to glucose repression.
A $\alpha$-l, 4-D-glucan maltohydrolase $(\beta$-amylase), secreted by the mesophilic aerobic bacterium Bacillus polymyxa No.26, was purified and characterized. The enzyme production was increased after a logarithmic phase of bacterial growth and paralleled with the onset of bacterial sporulation. By applying anion exchange chromatography and gel filtration the enzyme was purified 16.7-fold and had a specific activity of 285.7 units/mg. Two enzyme activities were eluted on a column of DEAE-Sephadex chromatography, and they were designated as E-I for a major enzyme peak and E-II for a minor peak. Of them, E-I enzyme peak was further purified by using gel chromatography. The molecular mass of this enzyme was determined to be 64, 000 daltons and consisted of a single subunit, showing an isoelectric point of 8.9. The enzyme was able to attack specifically the $\alpha$-l, 4-glycosidic linkages in soluble starch and caused its complete hydrolysis to maltose and $\beta$-limited dextrin. This amylolytic enzyme displayed a temperature optimum at $45^\circ{C}$ and a pH optimum at 7.0. The amino acid composition of the purified enzyme was quite similar to the other bacterial $\beta$-amylases reported. Surprisingly, the purified enzyme from this aerobe only exhibited hydrolytic activity on soluble starch, not on starch granules. The degradation of from starch by $\beta$-amylase was greatly stimulated by pullulanase addition. These results differentiated from other $\beta$-amylases reported. Based on a previous result that showed the enzyme system involves in effective degradation of raw starch granules, this result strongly suggested that the purified enzyme (E-I) can be a synergistic part of starch granule-digestion and E-II plays a crucial role in digestion of starch granules.
메밀성분에 대한 영양생화학적 가치를 알아보기 위하여 강원도산 메밀분의 일반성분, 무기질, 아미노산 조성을 분석하였고, 이것을 메밀면 제조원료로 사용하기 위하여 소맥분과 복합분을 만들어 일반성분 및 무기질을 분석하였다. 3가지 원료에 대한 일반성분의 차이는 대등하였고, 무기질은 메밀분에 종피가 많이 함유될수록 함량이 높았으며, 특히 수입메밀분에서는 특이하게 Ca, Fe, Mn의 함량이 높았다. 무기질의 종류는 Ca을 비롯하여 9가지가 정량되었으며 Se, Na, Mg 등이 풍부하여 영양학적 가치가 높이 평가되었다. 아미노산 조성은 필수아미노산 9가지를 비롯하여 모두 16종이 분석되었고, arginine은 강원도산 메밀에 특이하게 많았고, 수입메밀에서는 흔적으로 정량됨으로서 국내산 메밀이 영양학적 가치가 우수한 것으로 평가되었다. 제면과정중에 복합분의 호화도를 측정하기 위하여 extrusion 제면기로 8$0^{\circ}C$에서 제면하였을 때와 면을 냉동건조 그리고 냉장하였을 때 호화도의 변화를 BAP법으로 분석한 결과 제면 직후 시료는 76% 정도로 호화되었고, 냉장저장 과정중에 노화현상이 다소 일어난다는 것을 확인하였다.
한국에서 재배되고 있는 긴마, 단마 및 참마에서 분리한 전분의 특성을 조사한 결과는 다음과 같다. 전분의 평균 입자크기는 각각 단마 $23.5{\mu}m$, 긴마 $23.9{\mu}m$ 및 참마 $18.2{\mu}m$로 나타났고 표면 형태는 품종에 관계없이 불규칙한 난형을 나타내었으며 입자의 표면은 매끈하였다. 마전분의 아밀로오스 함량은 $29{\sim}33%$였고 물결합력은 $109.9{\sim}118.3%$ 였으며 온도변화에 따른 광투과도는 $70{\sim}75^{\circ}C$에서 상승 현상을 나타내는데 특히 참마는 $85^{\circ}C$부근에서 double stage 형태를 나타내었다. 팽윤력과 용해도는 단마가 다소 높은 수치를 나타내었고, 5% 마전분의 아밀로그램에 의하면 $80.3{\sim}84.3^{\circ}C$의 높은 호화 개시온도로 $95^{\circ}C$에서 가열시 계속적인 점도 상승 현상을 나타내었다. 마전분에 glucoamylase를 작용시킨 결과 반응 48시간후 최고 34%의 낮은 분해율을 보인반면 DMSO에 의해서는 반응 48시간 후 최고 100%의 용해율을 나타내었다. 마전분 및 전분에서 분리, 정제한 아밀로오스와 아밀로펙틴의 ${\beta}-amylolysis limit$는 마전분의 경우 $71.8{\sim}75.5%$를 나타내었고 아밀로오스에 있어서는 $90.2{\sim}92.1%$였으며 아밀로펙틴의 경우 $63.7{\sim}66.9%$를 나타내었다. 전분을 Sepharose CL-2B column으로 겔 크로마토그라피한 결과 모두 2개의 peak로 분리되었으며 pullulanase로 마밀로펙틴의 ${\alpha}-1,6-glucosidase$결합을 가수분해시킨 후 Sephadex G-75로 겔 크로마토그라피한 결과 peak II와 peak III의 정점에서의 중합도는 각각 15와 40부근이며 peak II에 대한 peak III의 중량비는 $2.15{\sim}2.42$ 분포를 나타내었다.
밤 전분의 이화학적 성질, 분자구조적 성질, 산처리 전분의 성질, 전분겔의 특성에 대하여 시험하였다. 아밀로오스 함량은 18.9%였고 X-선 회절도는 $C_b$형을 나타내었다. 팽윤력은 $65^{\circ}C{\sim}75^{\circ}C$까지 급격히 증가하고 그보다 높은 온도에서는 완만히 증가하였고, 용해도는 $70^{\circ}C$까지는 직선적으로 증가하나 그보다 높은 온도에서 는 완만히 증가하였다. 가열온도를 $75^{\circ}C,\;85^{\circ}C,\;95^{\circ}C$로 달리한 아밀로그래프에서 $50^{\circ}C$에서의 냉각점도는 가열온도가 증가함에 따라 낮아졌다. 밤 전분 아밀로오스의 최대흡수파장은 640nm, ${\beta}$-아밀라아제 분해한도는 84.2%, 중합도는 951이었고 아밀로펙틴의 최대흡수파장은 570nm, ${\beta}$-아밀라아제 분해한도는 58.2%, 중합도는 1371, 평균사슬길이는 22.6이었다. 전분 및 아밀로오스의 겔 크로마토그래피 용출결과 저분자량($<5{\times}10^5$)의 분자들이 각각 4.0%, 11.5%로 용출되었다. $75^{\circ}C,\;85^{\circ}C,\;95^{\circ}C$ 등 세 온도에서 용출한 가용성 전분의 겔 크로마토그래피 용출양상에서 높은 온도에서 용출한 것일수록 큰 분자량의 전분이 많이 용출되었다. 아밀로펙틴을 pullulanase로 분해시켰을 때 얻어진 가지부분들의 분자량분포에서 피크II(DP 35-45)에 대한 피크III(DP 10-15)의 비율은 2.2였다. 2.2 N HCI로 $35^{\circ}C$에서 10일간 산처리한 밤 전분의 가수분해율은 96%에 이르렀고 가수분해는 4일째를 경계로 두 단계의 다른 가수분해 속도를 나타내었다. 산처리 전분의 겔 크로마토그래피 용출양상에서 초기 6시산 후에 아밀로펙틴 피크가 완전히 사라졌고 산처리 기일이 증가함에 따라 DP 10-15의 짧은 사슬로 분해되었다. 아밀로오스 함량은 산처리 6시간 후까지는 증가하다 그 이후는 감소하였다. 밤 전분겔의 견고성은 $75^{\circ}C$로 가열하여 만든 전분겔에서 가장 높았고 응집성은 $85^{\circ}C$로 가열하여 만든 전분겔에서 가장 높았다. 전분겔의 노화속도는 비교적 빨랐으며 특히 $75^{\circ}C$로 가열하여 만든 전분겔에서 가장 빨랐다.
Bacillus circualans S-1으로부터 새로운 균체외 pullulan 6-glucanohydrolase(EP)를 정제하였다. 정 제된 EP는 SDS하에서 140kDa의 분자량을 나타내었으며, pI는 5.5이었다. SDS-PAGE에 의해 분석된 이 EP는 Schiff staining에 대하여 negative이었으며, 또한 아미노 말단기 순서는 P-L-N-M-S-Q-P이었 다. 정제된 EP는 6$0^{\circ}C$ 부근의 최적온도와 pH 9.0 부근에서 최적 pH를 나타내었으며, pH 4.0에서 pH 11 까지 4$^{\circ}C$에서 24시간동안 반응에서도 안정하였다. 또한 기질로 사용된 Pullulan은 열불안정화로부터 효 소를 보호하였으며, 그 범위는 기질 농도에 의존하였다. 이 EP의 활성은 Mn2+, Ca2+ 이온 에 의하여 활성화되었으며, amylopectin, glycogen, $\alpha$,$\beta$-limited dextrin 및 pullulan의 $\alpha$-1,6-linkage를 가수분해 하였다. 정제된 EP는 pH 9.0 및 5$0^{\circ}C$에서 측정하였을 때 pullulan의 경우는 7.92mg/ml의 Km값을 각각 나타내었다. 또한 정제된 EP는 pullulan을 maltotriose까지 완전히 가수분해하였다. 그리고 Mouse anti-serum과 함께 western blotting 분석결과 정제된 EP는 배양과정중 단일 형태로 생산되는 것으로 나타났다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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