• Archives of Pharmacal Research
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• 제20권3호
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• pp.206-211
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• 1997

The optimal conditions for the production and regeneration of the protoplasts from Lentinula edodes were studied. Protoplast formation from the mycelia of L. edodes which were cultured in liquid medium showed a significantly high yield compared with that of the mycelia which were cultured on cellophane covered agar media. A mixture of Novozyme 234 (15 mg/ml) and Cellulase Onozuka R10 (10 mg/ml) in 0.6 M mannitol (pH 4) was optimal lytic enzyme for the protoplast release. The optimal incubation time and mycelia age were 3.5-4 hours at $30^{\circ}C$ and 6-8 days, respectively. Regeneration frequency was 0.18% plated onto a medium containing 0.6 M sucrose, and 0.08% plated onto a medium containing mannitol. But hardly any regeneration was observed in the media containing NaCl, KCl, or $MgSO_{4}$ More than 90% of the protoplasts contained nuclei and the nucleus number per protoplast was 1.1. The DNA content per nucleus was 5.1 pg. The diameter of the protoplast was $3-5{\mu}m$ and it had a well defined cell structure.

• 미생물학회지
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• 제27권4호
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• pp.422-429
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• 1989

Auxotrophic mutant were isolated from wild types by the treatment with NTG as a mutagen, and the conditions of protoplast formation for them were established. The protoplasts of killer yeast Saccharomyces cerevisiae K52 were formed to the level of above 70% when cells grown for 20 hr in PM medium were treated with 200 unit/ml Lyticase 50,000 at $30^{\circ}C$ for 60 min after pretreatment of 50 mM 2-mercaptoethanol in 10mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing EDTA and 0.6 M sorbitol for 15 min. Also, the protoplast of the recipient S. cerevisiae S 29 were formed to the level of above 85% as it was cultured to the log phase of 24 hr in PM medium under the same conditions. The fusion frequency between the protoplast of killer yeast S. cerevisiae K 52 and the protoplast of recipient S. cerevisiae S 29 was reached to $8.2\times 10^{-6}$ when the hypertonic regeneration medium embeded with the fused protoplasts after mixing the parental protoplasts to 10$^{8}$ cells/ml in SP buffer containing 20 mM $CaCl_{2}$ and 30% PEG 6,000 for 15 min at $30^{\circ}C$ were incubated.

• 한국균학회지
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• 제20권1호
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• pp.44-50
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• 1992

Rhizoctonia solani의 균사융합군(AG) 중에서 생장속도가 빠른 AG-1과 AG-4는 가장 많은 원형질체를 형성하였으며 속도가 느린 AG-3은 저조하였고 중간인 AG-2와 AG-5는 또한 중간이었다. 균핵의 형성은 AG에 따라 차이가 있었다. Cellulase "onozuka" R-l0, macerozyme R-10, ${\beta}-glucuronidase$의 효소 복합액에서 가장 많은 원형질체를 형성하였다. 5개 융합군은 30시간 배양한 3g의 균사를 0.6 M mannitol이 첨가된 효소 복합액에 $32^{\circ}C$에서 3-4시간 처리하면 가장 많은 원형질체를 형성하였다. 균핵을 형성하는 AG-1을 열처리로 불활성화시킨 후 균핵을 형성하지 않는 AG-5의 원형질체를 PEG와 ${Ca}^{2+}$로 융합시켰다. 재생배지상에서의 균총의 특징과 균핵의 형성에 의해 7 개의 원형질 융합체를 선발하고 esterase 동위효소의 zymogram 및 AG-1 과 융합체인 F150l 사이에서 일어나는 killing reaction으로 확인하였다.

• Applied Microscopy
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• 제14권2호
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• pp.38-51
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• 1984

Fine structure of dormant and swollen conidiospore from Trichoderma koningii and the mechanism of protoplasting from the conidiospore were studied by scanning and transmission electron microscopy. The cell wall of dormant conidiospore was two-layered structure which consisted of electron dense outer layer and electron transparent inner layer. After 8.5 hrs incubation. the conidiospore was swollen and the outer layer of cell wall shown unequal thickness and partial breakage. Protoplast was released through the pore which has been formed by the breakage of outer layer and dissolution of newly synthesized cell wall for germ-tube formation. Swollen conidiospore and protoplast in releasing process contained various cell organelles and vacuoles with electron dense materials. The protoplast contained looser cytoplasm and had no cell wall materials outside of plasmamembrane.

• 한국균학회지
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• 제15권1호
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• pp.14-18
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• 1987

This experiment was undertaken to investigate proper conditions for protoplast formation from Lyophyllum ulmarium. Combination of Novozym 234, ${\beta}-Glucuronidase$ and ${\beta}-D-Glucanase$ with 0.6 M Sucrose was the most effective for isolation of protoplasts. The optimal reaction time of mycelium with the lytic mixture was 3 hrs in shaking condition at 120 strokes $min-^1$. When the mycelium of L. ulmarium was cultured for 6 days on yeast glucose agar medium at $25^{\circ}C$, the formation of protoplasts was effective. The yeast glucose agar medium stabilized with 0.6 M sucrose was the most effective for reversion of protoplasts.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제49권4호
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• pp.331-338
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• 2022

Sunflower (Helianthus annuus L.) protoplasts were isolated from seven-day-old etiolated hypocotyls of 10 A line and four-week-old fully expanded young leaves of PI 441983 line in vitro seedlings using an enzymatic method. Purified protoplasts were collected by filtration and floatation in sucrose solution. Semi-solid protoplast culture was performed using the L4 regeneration protocol with various culture media and plating densities to achieve the highest efficiencies for protoplast culture of hypocotyl and mesophyll protoplasts of 10 A and PI 441983 lines, respectively. The concentrations in liquid L'4M medium and different plating densities were evaluated in two types of cytokinins, the adenine-type 6-benzyladenine (BA) and the phenylurea-type thidiazuron (TDZ). The highest colony formation was achieved in both sunflower lines when 0.5 mgL^-1 BA and 0.5 mgL^-1 TDZ were applied with a high plating density (3 × 10⁵ protoplasts mL^-1). These conditions led to 38.45% and 39.40% colony formation for hypocotyl protoplasts of the 10 A line and mesophyll protoplasts of the PI 441983 line, respectively. Moreover, many hypocotyl protoplast-derived colonies developed into micro-calli. In addition, superior development of both sunflower protoplasts was observed with all plating densities when BA was used in combination with TDZ. This finding will be applicable to future sunflower hybrid production via somatic hybridization.

• 미생물학회지
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• 제28권4호
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• pp.304-310
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• 1990

고온 혐기성 Clostridium thermocellum 및 Clostridium thermohydrosulfuricum의 원형질체 형성 및 재생조건에 대하여 조사하였다. 원형질체 형성은 C. thermocellum의 경우, 0.2% glycine을 첨가한 배지에서 초기대수증식까지 생육한 cell을 0.5mg/ml의 lysozyme을 함유한 100mM TMG buffer(pH 7.5)에서 $37^{\circ}C$, 2시간 처리 했을 때 가장 좋았으며, C. thermohydrosulfuricum은 대수증식기의 cell을 동일 조건에서 0.2mg/ml의 lysozyme으로 처리했을 때 양호하였다. 원형질체 재생은 0.3-0.4M sorbitol. 0.5% casamino acid, 고농도의 $CaCl_2$를 첨가한 재생배지에서 $60^{\circ}C$, 7-10일간 배양했을 때 잘 되었으며, 원형질체 형성시 lysozyme의 처리 시간이 짧을 수록 좋았다. 재생빈도는 C. thermocellum의 경우 $4.85{\times}10^{-3}$, C. thermohydrosulfuricum의 경우 $4.23{\times}10^{-2}$ 이하로 낮은 편이었다. 재생배지에 나타난 colony에는 완전히 재생되지 않은 L-form cell도 함께 존재하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제16권2호
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• pp.150-155
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• 1988

L-Lysine 생산균주인 Brevibacterium flavum ATCC 14067 과 Corynebacteriurn glutamicum ATCC13032에 섬유소 자화능이 우수한 Cellulomonas flavigena KFCC31221를 속간 융합시켜 섬유소로부터 L-lysine을 생산할 목적으로 이들 균주의 영양요구성 변이주 분리, 원형질체의 형성 및 재생의 조건을 조사하였다. NTG(500$\mu\textrm{g}$/$m\ell$)로 유기하여 penicillin-G(300$\mu\textrm{g}$/$m\ell$)로 농축한 변이주에서 B. flavum은 hse- str$^{r}$(100$\mu\textrm{g}$/$m\ell$), C. glutamicum는 Met$^{-}$T$hr^{-}$ Rif$^{r}$(5$\mu\textrm{g}$/$m\ell$), C. flavigena 는 T$hr^{-}$Val$^{-}$Kan$^{r}$(50$\mu\textrm{g}$/$m\ell$)의 gene marker를 가지는 영양요구성과 약제내성균주를 분리하였다. 공시균주의 원형질체 형성은 osmotic stabilizer로서는 0.5M sucrose, 배양기간은 대수증식기 중기의 균이 양호하였고, lysozyme 최적 처리 pH, 온도, 농도 및 반응시간은 각각 pH6.5, 33$^{\circ}C$, 500 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$, 6시간으로 나타났으며, 이때의 원형질체형성율은 95-98%였다. 원형질체를 1.5% agar가 함유된 완전재생용 배지위에 0.7% agar가 함유된 완전재생용 배지로 중층했을 때 약 30~33%의 재생율을 보였다.

• 한국균학회지
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• 제18권3호
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• pp.115-126
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• 1990

구름버섯은 항종양작용이 인정되었으며 근자에는 AIDS virus에 대한 억제효과가 보고되고 있다. 이와 같은 약효를 인정받고 있는 구름버섯 균주간의 세포융합이나 구름버섯과 타 유효한 버섯과 세포융합을 시행함으로써 더욱 효능이 우수하거나 다양한 균주의 약효를 한 균주내에서 기대할 수 있는 새로운 균주의 개발이 가능하다. 이러한 목적으로 구름버섯의 원형질체융합을 시행하기 위하여, 원형질체분리, 재생 및 두 영양요구주의 융합에 관하여 실험하였다. 균사체를 2.5일간 셀로판지위에서 배양하여 Novozym 234와 cellulase Onozuka R-10이 각각 15 mg/ml와 10 mg/ml 포함되어 있는 0.6M sucrose 용액에 넣어 $30^{\circ}C$에서 3-4.5시간 반응시킬 때 원형질체 수득률이 가장 높았다. 삼투압 안정제로 0.6M sucrose는 원형질체 형성과 재생에서 최적조건이었다. 0.6M sucrose를 포함하는 고체배지에서의 재생빈도는 3.48%이었으며 UV 조사시 생존률은 0.02-7.4%이었다. 원형질체융합은 $30^{\circ}C$에서 10분 동안 polyethylene glycol(M.W. 4,000)을 이용하여 시행하였는데 그 융합빈도는 1.86%이었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제13권4호
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• pp.377-382
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• 1985

이속 효모간 원형질체 융합에 의해 새로운 알콜발효 균주를 개발하기 위한 전단계로서, Arthro-bacter luteus에서 얻은 zymolyase 5,000을 세포벽 분해효소로 사용하여 전분분해 효모인 C. tropicalis, E. fibuligera 및 알콜발효 효모인 S. cerevisiae 등의 원형질체 형성조건에 대하여 검토하였다. 원형질체 형성의 최적 pH와 온도는 각각 pH 7.5와 35$^{\circ}C$였다. 또한 원형질체 형성에 대한 2-mercapto-ethanol의 효과는 50mM농도에서 가장 좋았으며 삼투압 안정제로는 0.6M KCl이 적당하였다.