식물조직을 분해하여 단세포화하는 효소, protopectinase를 생산하는 다수의 미생물을 토양에서 분리하였다. 이들 분리된 미생물의 배양여액에서 얻어진 조효소를 감자조직에 처리하여 단세포화된 감자세포를 확인할 수 있었다. 이들 미생물 중에서 비교적 높은 protopectinase의 효소활성을 보이는 균주를 선택하여 형태관찰 결과로부터 Rhizopus sp.임을 알 수 있었다. 선별된 균주 Rhizopus sp. R2의 배양여액에서 얻어진 protopectinase를 이용하여 감자조직의 단세포화를 시도하여 $40^{\circ}C$, pH 4 하에서 최적의 효소반응 조건을 보였다.
Protopectinases are heterologous group of enzymes that degrades insoluble protopectin which consists of middle lamella between cells of plant tissues. Tissues of potato and carrot could be separated to single cells by addition of protopectinase isolated from Rhizopus sp. Color changes ofthe suspensions treated with protopectinase and mechanically macerated after 2 weeks at 4$^{\circ}C$, were investigated. Color change of the latter was very serious, however, that of the former was insignificant. Furthermore, after heat treatment at 121$^{\circ}C$ for 5min, the constituents of mechanically macerted carrot suspension were separated into two layers, but those of single celled carrot were not. Yields of carrot juices extracted from single celled suspensions and mechanical maceration were 93.6% and 56.0%, respectively. These results support that treatment of protopectinase can increase yield of juices extracted from plant, and manufacture high value-added products in food processing.
In this study Bacillus subtilis PTCC 1023 was used for the production of protopectinase using soybean based media. The use of isolated soybean protein (ISP) and soybean flour resulted in similar protopectinase production and growth rates. The effect of medium composition on protopectinase production was studied using central composite design (CCD) methodology. The change in the concentration of ISP (1-7%), glucose (0-10%), and phosphate (0.1-0.3 M) was found to affect the protopectinase activity (response variable) after 24 hr of cultivation. In the range studied, ISP and glucose had a negative effect on the response variable, whereas phosphate had a positive effect. A statistically significant interaction was identified between phosphate and ISP, suggesting that correct optimization of medium formulation in this case can only be obtained using factorial design of experiments. Protopectinase activity exceeding 215 U/mL was obtained in a medium containing 4% ISP, 0.3M phosphate, and no added sugar.
가공식품의 개발에 있어서 식품의 맛과 더불어 저장성, 열안정성 및 색도유지는 소비자의 기호도에 중요한 영향을 미친다. Protopectinase는 식물조직 중엽부의 성분인 불용성 proto-pectin을 분해하여 단세포화하는 효소이다. Protopectinase를 포도에 적용시켜 포도 고유의 세포속에 함유되어 있는 세포내 성분들을 파손없이 단세포로 유리하였다. pH, 총산 함량, 총 폴리페놀함량 및 항산화력은 기계 처리구보다 효소 처리구에서 보다 안정성을 나타내었으며 이는 단세포 처리에 의하여 이들 성분이 안정하게 유지됨을 알 수 있었다. Protopectinase로 처리된 포도 단세포화물을 $4^{\circ}C$에서 28일간 저장하며 색도를 관찰한 결과, 단세포 처리구에서는 기계 처리구보다 색도의 차이가 미비하였으며 기계 처리구에서는 단세포 처리구보다 색의 변화가 크게 나타났다. 또한 포도 단세포화물을 $80^{\circ}C$에서 30분간 열처리한 후 관찰한 결과, 기계 처리구의 경우가 단세포 처리구의 경우보다 품질의 변화를 크게 나타내어 이러한 결과는 효소적 단세포화물의 열 안정성을 의미한다. 따라서 Protopectinase를 이용한 포도의 단세포화는 과실음료제조 및 원료보존에 유용하게 응용가능하며, 나아가 포도 단세포화물의 폭넓은 식품 소재화 가능성과 고부가가치 기능성 식품제조에 이용 될 수 있음을 의미한다.
마늘의 향미성분을 가급적 그대로 유지하고 착즙수율을 향상시킬 수 있는 착즙방법을 개발하고자 하였다. 착즙수율을 향상시키기 위하여 protopectinase와 복합요소(cellulase, pectinesterase 및 ${\beta}-glucanase$ 등이 혼합된 효소)를 마늘펄프로부터 1차로 착즙하고 남은 잔사에 적용하여 마늘주스의 수율증가율과 향미성분 변화를 측정하였다. 착즙 전 마늘펄프 무게에 대하여 효소를 0.04, 0.08 및 0.12%씩 가하여 30, 60, 90 및 120분간 각각 가수분해하였다. 마늘주스의 수율 증가는 최대수율에 도달할 때까지 효소의 첨가량 및 반응시간의 증가와 더불어 증가하였다. 0.12%의 protopectinase를 첨가하여 90분간 가수분해하여 착즙한 결과 수율은 13.8%가 증가하였다. 복합효소를 0.12% 첨가하여 90분간 가수분해 후 착즙한 경우에는 최대수율인 14.5%의 증가효과가 있었다. GC로 휘발성 향기성분을 분석한 결과 효소를 처리하지 않은 대조구(control)와 총 피크면적으로 계산하여 비교할 경우 감소하였다. 0.12%의 protopectinase를 가하여 60분간 분해 후 제조한 마늘 주스의 휘발성 향기성분 향량은 약 6%가 감소하였다. 마늘주스의 유리당 함량은 0.12%의 protopectinase를 가하여 60분간 분해후 제조한 마늘 주스가 대조구와 가장 유사한 함량을 나타내었다. 유리아미노산 함량은 사용한 효소의 종류에 영향을 크게 받지 않는 것으로 나타났다. 이상의 결과로부터 0.12%의 protopectinase를 마늘착즙잔사에 가하여 60분간 분해 후 착즙한 액을 마늘펄프로부터 직접 착즙한 액과 혼합하면 착즙수율을 최대로 증가시키고 향미 성분의 변화를 최소화시킬 수 있는 것으로 나타났다.
A fungus with the highest protopectinase productivity was selected among 205 strains isolated from the soil and identified as a Verticillium sp. The Verticillium sp. was cultivated on wheat bran and the crude extruct of its culture medium showed the highest protopectinase activity on the following conditions: 3 days of cultivation time, 27$^{\circ}C$ of cultivation temperature, 1.2 $m\ell$/g wheat bran of water content, and reinforcement of ammonium nitrate and calcium chloride at the concentration of 0.5 and 0.02%, respectively. The optimum conditions for pectin production from Citrus peel pulp by the protopectinase were consequently obtained as follows: 20$m\ell$/g of liquid volume-to-pulp weight ratio, 4$0^{\circ}C$ of reaction temperature, and 4 of reaction pH. The higher the enzyme concentration, the better the yield of pectin and the shorter the reaction time. Total 45.6mg of pectin/g peel was produced by 1 hour reaction at the enzyme concentration of 10.5 units/$m\ell$. Molecular weight of the pectin produced by the enzyme was estimated to be about 62,000 by Smit and Bryant's method.
It was pointed out by Katagiri and Nakahama that the useful retling bacteria acted selectively on vegetable fiber materials and also they proposed that this selectivity was based on the specificity of protopectinase of the bacteria, and that the two characters might have certain parallel relation with each other. The result of the further experiments carried out by the author with mulberry-tree bark also confirmed the selectivity of some kinds of retling bacteria, but found no remarkably different action on protopectin from mulberry-tree bark. Accordingly no parallel relation between the selectivity of the retling bacteria and the specificity of the protopectinase was identified.
Protopectinase는 불용성의 프로토펙틴을 수용화시켜 펙틴을 생산하는 효소로서, 사과박으로부터 펙틴추출을 위한 최적 pH, 반응시간, 반응온도를 조사하였다. 효소 작용 최적조건은 pH 7.8, $60^{\circ}C$에서 48시간의 반응시간이었으며, 펙틴 추출률은 34.3%이었다. 최적조건에서 protopectinase에 의해 추출된 펙틴의 순도는 52.9%이었으며, methoxyl 함량은 2.75%로서 저 methoxyl 함량의 펙틴이었다. 효소 반응 온도와 시간은 펙틴의 추출률과 methoxyl 함량에 크게 영향을 미치지 않았지만 반응 pH는 사과박의 펙틴 추출률과 methoxyl함량에 크게 영향을 미쳤다. 최적조건에서 추출된 펙틴의 고유점도와 분자량은 각각 0.178 ml/g과 4,900이었다.
Protopectinase(PPase)는 식물 세포벽의 protopectin을 분해하는 효소로서 식품의 가공에 이용될 수 있는 효소이다. PPase의 산업적 응용을 위하여 PPase를 생산하는 미생물 Bacillus subtilis IFO 12113의 배양여액에 acetone, methanol, ethanol을 각각 처리하여 PPase를 회수하는 연구를 수행하였다. Acetone의 경우, 배양여액 대 acetone을 1:1 (v/v) 비율로 첨가했을 때 효소는 59.2%가 회수되었으며 정제도는 1.7배 이었다. Methanol의 경우, 1:2(v/v) 비율로 처리하였을 때, 효소는 100% 회수되었으며 비활성도로 본 정제도는 4.0배 증가하였다. Ethanol의 경우에 1 :0.5 (v/v) 비율로 처리한 것을 원심분리시켜 침전물을 제거하고, 그 상등액에 최종 ethanol 비율을 1:1(v/v)까지 처리했을 때, 효소의 회수율은 68%를 나타냈으며 비활성도는 13.5배 증가하였다. 세균의 배양여액으로부터 PPase의 회수에는 methanol 처리가 가장 효율적이었으나, 산업적 응용을 위하여 정제효과까지 고려하면 ethanol처리가 가장 적절하였다.
The protopectinase from the culture extract of a Verticillium sp. was purified about 1000 fold by ammonium sulfate fractionation, DEAE-Sephadex treatment and Sephadex G-75 column chromatography. The purified enzyme was homogeneous on electrophoresis and its molecular weight was estimated to be 38000 by Andrew's gel filtration, method. The enzyme was almost stable under the temperature of 4$0^{\circ}C$ and within the pH range of 3-5. Its optimum pH and temperature were 4 and 4$0^{\circ}C$, respectively. The activity was markedly inhibited by galacturonic acid. The purified enzyme was able to macerate various kinds of plant tissues, such as radish, cucumber, onion, carrot, and potato. It also reduced the viscosity of pectin solution more rapidly than that of pectic acid solution and showed no lyase or CMCase activity.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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