• Journal of Plant Biotechnology
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• 제45권4호
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• pp.322-327
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• 2018

Post-translational modification of proteins regulates signaling cascades in eukaryotic system, including plants. Among these modifications, phosphorylation plays an important role in modulating the functional properties of proteins. Plants perceive environmental cues that directly affect the phosphorylation status of many target proteins. To determine the effect of environmentally induced phosphorylation in plants, in vivo methods must be developed. Various in vitro methods are available but, unlike in animals, there is no optimized methodology for detecting protein phosphorylation in planta. Therefore, in this study, a robust, and easy to handle Phos-Tag Mobility Shift Assay (PTMSA) is developed for the in vivo detection of protein phosphorylation in plants by empirical optimization of methods previously developed for animals. Initially, the detection of the phosphorylation status of target proteins using protocols directly adapted from animals failed. Therefore, we optimized the steps in the protocol, from protein migration to the transfer of proteins to PVDF membrane. Supplementing the electrophoresis running buffer with 5mM $NaHSO_3$ solved most of the problems in protein migration and transfer. The optimization of a fast and robust protocol that efficiently detects the phosphorylation status of plant proteins was successful. This protocol will be a valuable tool for plant scientists interested in the study of protein phosphorylation.

• Molecules and Cells
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• 제46권4호
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• pp.191-199
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• 2023

The Golgi apparatus modifies and transports secretory and membrane proteins. In some instances, the production of secretory and membrane proteins exceeds the capacity of the Golgi apparatus, including vesicle trafficking and the post-translational modification of macromolecules. These proteins are not modified or delivered appropriately due to the insufficiency in the Golgi function. These conditions disturb Golgi homeostasis and induce a cellular condition known as Golgi stress, causing cells to activate the 'Golgi stress response,' which is a homeostatic process to increase the capacity of the Golgi based on cellular requirements. Since the Golgi functions are diverse, several response pathways involving TFE3, HSP47, CREB3, proteoglycan, mucin, MAPK/ETS, and PERK regulate the capacity of each Golgi function separately. Understanding the Golgi stress response is crucial for revealing the mechanisms underlying Golgi dynamics and its effect on human health because many signaling molecules are related to diseases, ranging from viral infections to fatal neurodegenerative diseases. Therefore, it is valuable to summarize and investigate the mechanisms underlying Golgi stress response in disease pathogenesis, as they may contribute to developing novel therapeutic strategies. In this review, we investigate the perturbations and stress signaling of the Golgi, as well as the therapeutic potentials of new strategies for treating Golgi stress-associated diseases.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제46권2호
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• pp.185-194
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• 1999

연구배경: NF-$\kappa$B는 단백질이 생성된 후의 변형(post-translational modification)과 세포내에서의 위치 변화(subcellular localization)에 따라 그 작용이 결정되는 특성을 가진 전사 인자로서 최초에는 면역반응에 있어 중요한 역할을 하는 사실이 알려졌으나 그후 이러한 작용이외에도 급성기 염증 반응, 바이러스의 증식, 세포의 발생과 분화에 있어 중요한 작용을 한다는 사실이 알려지게 되었다. 최근의 연구들에서 NF-$\kappa$B 전사 인자가 정상 세포로부터 암세포로의 형질전환에 있어서도 어떤 기능을 할 것이라는 사실들이 알려지게 되었다. NF-$\kappa$B가 암세포로의 형질 전환, 나아가 암세포의 생성에 어떤 역할을 제공한다면 이러한 사실은 나아가 향후의 암치료에 있어서도 유용한 지식이 될 수 있다. NF-$\kappa$B 전사 인자가 인체 암세포에 있어서 세포의 형질 변환에 연관될 수 있다는 사실은 몇몇 암종에서 알려져 있으나 폐암에서의 NF-$\kappa$B 전사 인자의 종양 생성기능에 있어서는 아직 연구된 바가 없다. 방 법: 본 연구에서는 배양된 인체 폐암세포주에 있어서 NF-$\kappa$B family 전사 인자들의 발현정도를 western blot를 이용하여 관찰하고 과발현된 NF-$\kappa$B 전사 인자의 세포내 위치가 세포핵인지 세포질내에 존재하는 것인지를 각각의 단백질 분획에서 western blot를 시행하여 관찰하였고 또한 immunocy-tochemistry를 시행하여 그 발현 양상을 확인하였다. 존재하는 NF-$\kappa$B 전사 인자가 어떠한 복합체의 형태인지를 알아보기 위하여 세포주의 단백 추출물에서 NF-$\kappa$B family 전사 인자에 대한 항체를 사용하여 immunoprecipitation을 시행하였다. 세포주 단백추출물의 $\kappa$B consensus oligonucleotide에의 결합여부를 보기위하여 electrophoretic mobility shift assay를 시행하였다. 결 과: 배양된 인체 폐암세포주에서는 NF-$\kappa$B family의 p50 subunit, p65 subunit가 발현되어 있었고 p50 subunit의 발현은 세포핵내에 국한하여 위치하고 있음을 western blot와 immunocytochemistry를 통하여 관찰할 수 있었다 immunoprecipitation assay는 세포내에서 p50 subunit가 p65 subunit와 복합체를 이루는 상태로 존재하고 있음을 보여주었다. 폐암세포주의 세포핵 추출물은 NF-$\kappa$B consensus oligonucleotide와 결합할 수 있음을 electrophoretic mobility shift assay를 통하여 확인할 수 있었다. 결 론: 인체 폐암세포주에서 NF-$\kappa$B family 전사 인자의 발현이 활성화되어 있으며 NF-$\kappa$B family 전사 영자가 인체 폐암 형성에 있어 어떤 역할을 할 가능성을 시사한다.

• BMB Reports
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• 제40권2호
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• pp.247-260
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• 2007

Cinnamate 4-hydroxylase (C4H) is a key enzyme of phenylpropanoid pathway, which synthesizes numerous secondary metabolites to participate in development and adaption. Two C4H isoforms, the 2192-bp BnC4H-1 and 2108-bp BnC4H-2, were cloned from oilseed rape (Brassica napus). They both have two introns and a 1518-bp open reading frame encoding a 505-amino-acid polypeptide. BnC4H-1 is 57.73 kDa with an isoelectric point of 9.11, while 57.75 kDa and 9.13 for BnC4H-2. They share only 80.6% identities on nucleotide level but 96.6% identities and 98.4% positives on protein level. Showing highest homologies to Arabidopsis thaliana C4H, they possess a conserved p450 domain and all P450-featured motifs, and are identical to typical C4Hs at substrate-recognition sites and active site residues. They are most probably associated with endoplasmic reticulum by one or both of the N- and C-terminal transmembrane helices. Phosphorylation may be a necessary post-translational modification. Their secondary structures are dominated by alpha helices and random coils. Most helices locate in the central region, while extended strands mainly distribute before and after this region. Southern blot indicated about 9 or more C4H paralogs in B. napus. In hypocotyl, cotyledon, stem, flower, bud, young- and middle-stage seed, they are co-dominantly expressed. In root and old seed, BnC4H-2 is dominant over BnC4H-1, with a reverse trend in leaf and pericarp. Paralogous C4H numbers in Brassicaceae genomes and possible roles of conserved motifs in 5' UTR and the 2nd intron are discussed.

• KSBB Journal
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• 제20권4호
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• pp.278-284
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• 2005

식물세포의 느린 생장과 낮은 생산량의 이유로 지금까지 는 주로 미생물이나 동물세포에서 유전자 재조합 단백질을 생산하여 왔다. 그러나 저렴한 배지 가격, 동물 유래 바이러스 감염 위험성으로부터의 안정성, glycosylation 등의 post-translational modification이 가능하다는 장점들로 인하여 최근 들어 식물세포배양은 생물학적 활성을 가진 고부가가치의 단백질을 생산하는데 많이 이용되고 있다. 본 연구에서는 생장배지에 첨가했던 sucrose의 소비와 induction 배지로의 교환에서 오는 배지내의 삼투압을 조절하여 hCTLA4-Ig의 생산성을 높이고자 하였다. 다양한 삼투압 조절제 첨가 실험을 통해 sorbitol을 선별하고, 40 mM의 sorbitol 첨가에서 상대적으로 높은 생존도와 induction 후 7일째 대조구보다 1.7배 높은 생산성을 확인하였다. 또한, 저농도의 glucose 첨가를 통한 생산성 증대에 있어서는 8 mM glucose에서 induction 이후에도 높은 세포농도를 유지하면서 최대 37.3 mg/L까지 hCTLA4-Ig 생산량을 증가시켰다. 5-L bioreactor에서 회분식 배양과 induction시의 hCTLA4-Ig 생산량을 비교한 결과 induction시 배양 18일째 최고 45.3 mg/L까지 높일 수 있었으며, 회분식 배양에 비해 2.1배 증가됨을 확인하였다.

• Molecules and Cells
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• 제40권9호
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• pp.667-676
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• 2017

Abnormal differentiation of muscle is closely associated with aging (sarcopenia) and diseases such as cancer and type II diabetes. Thus, understanding the mechanisms that regulate muscle differentiation will be useful in the treatment and prevention of these conditions. Protein lysine acetylation and methylation are major post-translational modification mechanisms that regulate key cellular processes. In this study, to elucidate the relationship between myogenic differentiation and protein lysine acetylation/methylation, we performed a PCR array of enzymes related to protein lysine acetylation/methylation during C2C12 myoblast differentiation. Our results indicated that the expression pattern of HDAC11 was substantially increased during myoblast differentiation. Furthermore, ectopic expression of HDAC11 completely inhibited myoblast differentiation, concomitant with reduced expression of key myogenic transcription factors. However, the catalytically inactive mutant of HDAC11 (H142/143A) did not impede myoblast differentiation. In addition, wild-type HDAC11, but not the inactive HDAC11 mutant, suppressed MyoD-induced promoter activities of MEF2C and MYOG (Myogenin), and reduced histone acetylation near the E-boxes, the MyoD binding site, of the MEF2C and MYOG promoters. Collectively, our results indicate that HDAC11 would suppress myoblast differentiation via regulation of MyoD-dependent transcription. These findings suggest that HDAC11 is a novel critical target for controlling myoblast differentiation.

• 생명과학회지
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• 제20권2호
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• pp.202-207
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• 2010

Ras 유전자는 30%의 인간암에서 변이가 발견되며 세 종류의 isoform, H-Ras, K-Ras 및 N-Ras로 구성되어 있다. Ras 단백질의 CAAX motif에 farnesylation과 같은 번역 후 변형은 Ras의 활성에 필수 요소이다. 본 연구에서는 새로운 farnesyl transferase 억제제인 YH3938과 YH3945의 발암원성 H-Ras, K-Ras 및 N-Ras의 작용에 대한 영향을 조사하였다. YH3938과 YH3945는 발암원성 H-Ras에 의해 형질전환된 Rat2 세포의 증식과 형태 변화를 억제하였으나 K-Ras에 대해서는 효과가 없었다. N-Ras에 대해서는 약한 영향이 있었다. H-Ras와 N-Ras에 의한 SRE promoter 활성화는 YH3938과 YH3945에 의해 억제되었으나, K-Ras에는 영향이 없었다. Ras 단백질의 bandshift 분석을 통해 YH3938은 H-Ras와 N-Ras의 번역 후 변환을 억제하였으나, K-Ras에는 영향이 없었다. YH3945는 H-Ras의 변환에만 영향이 있었다. 결론적으로 YH3938과 YH3945는 H-Ras의 farnesylation을 억제하여 그 발암원성을 억제하며, YH3938은 N-Ras 작용을 농도의존적으로 억제하며, K-ras에 대해서는 영향이 없음을 알 수 있었다.

• 식물조직배양학회지
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• 제28권5호
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• pp.283-287
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• 2001

감자 (Solanum tuberosum L. cv. Irish Cobbler)의 괴경형성과정 (tuberization) 동안에 발현하는 유전자들의 발현양상을 조사하고자 differential display법을 실시하였다. Differential display를 이용하여 분리된 eIF5A DNA단편을 probe로 사용하여 감자의 cDNA library screening을 통하여 eIF5A full-length cDNA를 감자에서 처음으로 분리하였다. 감자의 eIF5A, clone은 토마토의 eIF5A cDNA 염기서열과 94.8%. 아미노산 서열에서는 97.5%로 매우 높은 유사성을 나타내었다. 감자의 eIF5A 유전자는 길이가 716 bp로 하나의 단백질 code영역 (ORF)을 포함하고 있었다. 이 영역은 분자량 17.4 kD, pI 5.5로 추정되는 160개의 아미노산으로 구성된 eIF5A단백질을 code하고 있었다. eIF5A 단백질들에서 12개의 아미노산 서열 (STSKTGKHGHAK)은 효모에서 사람에 이르기까지 완벽하게 보존되어 있는 것으로 알려져 있는데, 감자에서도 또한 잘 보존되어 있었다. 이 영역은 eIF5A 단백질의 활성을 나타내는 데 있어서 필수적인 hypusine을 생성하는 전사 후 수식 부위가 들어 있는 아주 중요한 곳이다. 감자에서 eIF5A 유전자의 발현양상을 조사한 결과 감자의 전조직에서 발현을 보였는데, 성숙잎이나 괴경보다는 세포분열 및 물질축적이 활발히 일어나고 있는 꽃기관들 (stamen, ovary, petal. sepal), 과실 (fruit)과 stolen 등의 조직들에서 비교적 활발히 발현되고 있었다.

• 생명과학회지
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• 제23권2호
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• pp.324-331
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• 2013

O-GlcNAc 화(O-GlcNAcylation)는 단백질의 serine이나 threonine에 N-acetylglucosamine (GlcNAc) 분자가 결합하는 것으로, 기존의 당단백질과 달리 세포질 및 핵단백질 모두에 일어난다. 또한 수정의 속도가 빠르고 가역적으로 일어남이 인산화 수식과 유사하다. 그러나 수많은 인산화효소와 탈인산화효소가 관여하는 것과 달리 O-GlcNAc 수식은 O-GlcNAc transferase (OGT)와 O-GlcNAcase (OGA) 단 두 개의 효소에 의하여 이루어진다. 이러한 단순한 조절기전은 세포가 내외환경에 즉시 적응할 수 있도록 진화한 것으로 해석된다. 즉, O-GlcNAc 수식은 특정한 단백질 하나 하나의 활성을 켜거나 끄는 것이 아니라, 세포의 신호전달과정의 효율을 전반적으로 조절하는 '가변저항기(rheostat)' 역할을 한다. O-GlcNAc 수식은 흔히 같은 아미노산 혹은 그 주변의 아미노산이 인산화되는 것을 수반하는데, 이는 인산화와 함께 서로 조화를 이루어 세포활성을 조절하는 것으로 해석된다. 최근 O-GlcNAc이 더 나아가 O-GlcNAc-P로 인산화될 가능성이 제시되고 있는 바, 본 총설에서는 이의 가능성을 이론적으로 설명하고, 실제 실험결과를 소개한다.

• Advances in nano research
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• 제12권6호
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• pp.639-652
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• 2022

The prolyl 3-hydroxylase family member 4 (P3H4), is associated with post-translational modification of fibrillar collagens and aberrantly activated in cancer leading to tumor progression. However, its role in clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is still unknown. Here we reported that P3H4 was highly expressed in renal cancer tissues and significantly positive correlated with poor prognosis. Knockdown of P3H4 inhibited the proliferation, migration and metastasis of renal cancer cells in vitro and in vivo, and also, overexpression of it enhanced the oncogenic process. Mechanistically, P3H4 depletion decreased the levels of GDF15-MMP9 axis and repressed its downstream signaling. Further functional studies revealed that inhibition of GDF15 suppressed renal cancer cell growth and GDF15 recombinant human protein (rhGDF15) supplementation effectively rescued the inhibitory effect induced by P3H4 knockdown. Moreover, decreased levels of MMP9 caused by inhibition of P3H4-GDF15 signaling constrained the expression of PD-L1 and suppression of P3H4 accordingly promoted anti-tumor immunity via stimulating the infiltration of CD4+ and CD8+ T cells in syngeneic mice model. Taken together, our findings firstly demonstrated that P3H4 promotes ccRCC progression by activating GDF15-MMP9-PD-L1 axis and targeting P3H4-GDF15-MMP9 signaling pathway can be a novel strategy of controlling ccRCC malignancy.