• 한국수정란이식학회지
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• 제19권3호
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• pp.245-255
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• 2004

포유동물 난자의 체외수정은 외래유전자 도입에 의한 형질전환동물 생산과 우수한 형질을 가진 개체의 보존, 인간의 불임연구 등과 같은 수정란이식 기술로서 널리 이용되고 있다. 돼지 난포란을 이용한 체외수정란의 생산은 초기단계인 체외성숙 기술의 미확립, 그로인한 체외수정 시 높은 다정자 침입율과 불완전한 웅성전핵 형성 몇 체외발달능 정지현상(cell blocking) 등 어려움 때문에 아직도 다른 가축보다 양질의 수정란을 생산하기가 어려운 것으로 알려져 있다. 이와 같은 것을 해결하기 위하여 많은 연구자들은 배양액내에 hormon, growth factor, antioxdants 등과 같은 외인성 인자들을 첨가하고 있다. 이들 인자 중 antioxdant는 free radical을 소거하고 과산화물 생성을 억제하여 난자를 산화적 스트레스로부터 보호한다. 따라서 본 연구는 돼지 난포란으로부터 체외수정란의 생산에 있어서 배양액내 cysteine, catalase 및 glutathione의 첨가가 체외성숙, 체외수정 및 체외배양에 어떤 영향을 미치는지를 검토하였다. 실험 1은 체외성숙용 배양액인 TCM-199 용액에 catalase(100, 200, 500U/$m\ell$)와 glutathione(0.5, 1.0, 1.5mM/$m\ell$)의 첨가, 실험 2는 성숙된 난자의 체외수정용 배양액인 mTBM 용액에 cysteine(0.1, 1.6, 1.0mM/$m\ell$), catalase(100, 200, 500U/$m\ell$)와 glutathione(0.5, 1.0, 1.5mM/$m\ell$)의 첨가, 실험 3은 체외성숙 및 체외수정된 난자의 체외배양용 배양액인 NCSU-23 용액에 cysteine(0.1, 1.6, 1.0mM/$m\ell$), catalase(100, 200, 500U/$m\ell$)와 glutathione(0.5, 1.0, 1.5mM/$m\ell$)을 첨가하여 배반포로의 배 발달율을 관찰하였던 결과는 다음과 같다. 1. 체외성숙시 catalase의 경우는 500U 첨가군의 27.2%로 무첨가군의 15.4%보다 유의하게 높았다(p<0.05). 한편 glutathione의 경우 배반 포로의 배 발달율은 무첨가군과의 차이는 없었다. 그러나 1.0mM 첨가군에서 상실배까지의 배 발달율인 72%는 무첨가군의 53.9%보다 유의하게 높았다(p<0.05). 2. 체외수정시 여러 종류의 항산화제 첨가는 첨가하는 농도와 관계없이 배반포로의 배 발달율은 무첨가군과 차이가 없었다. 3. 체외배양시 여러 종류의 항산화제 첨가는 첨가하는 농도와 관계없이 배반포로의 배 발달율은 무첨가군과 차이가 없었다. 이상의 결과를 종합적으로 하면 돼지 난포란을 이용한 배반포의 체외생산에 있어서 배양액내 항산화제의 첨가는 체외성숙단계에서만 효과적이었다. 이것은 아마도 항산화제가 체외성숙 시 난포란 내에서 일어나는 여러 가지 생화학 반응의 처리시간과 관련하여 활성화시킴으로써 난포란의 생존력을 높인 것이라고 사료되기 때문에 앞으로는 돼지 난포란의 효율적인 체외성숙에 대해서 배양액내 첨가물질은 물론 나아가서 방법론적인 측면에서 더욱 연구되어져야 할 것이다.

• 한국가축번식학회지
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• 제21권3호
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• pp.239-246
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• 1997

본 연구는 돼지 난포란의 체외수정시 정소상체 미부정자의 형태학적 정상정자 비율에 따른 수정능의 차이를 조사하기 위하여 실시하였다. 그 결과는 다음과 같다. 1. 정소상체 미부로부터 회수된 전체의 정자중 형태학적 정상정자의 비율에 따른 ( 10%, 10~30%, 50%) 정자침입율과 다정자침입, 전핵형성율 그리고 난자에 침입한 평균 정자수를 조사하였던바, 50%의 정자침입율과 다정자침입은 82.4%와 87.4%로 10% (29.7%, 22.6%)와 10~30% (20.3%, 37.0%)보다 유의하게 높게 나타났다 (p<0.01). 또한, 공시된 난자의 전핵형성율도 50%이상의 형태학적 정상정자를 가진 실험군에서 유의하게 높게 나타났다(p<0.01). 2. 50% 이상의 정상정자를 가진 정소상체 미부정자를 100% (5$\times$105 cells/ml)로 조정하여 수정시킨 후 그 결과를 동결 융해된 사출정자와 비교하였던 바, 다정자침입과 전핵형성율은 정소상체 미부정자 (86.7%, 35.1%)와 동결 융해된 사출정자 (86.0%, 39.4%)간에 차이를 나타내지 않았으나, 정자침입율은 정소상체 미부정자가 79.7%로 동결 융해된 사출정자의 95.5%에 비해 유의하게 낮게 나타났다(p<0.01) 3. 또한, 정소상체 미부정자군에서 난자와 정자의 비율 (1:6000, 1:6650, 1:7700, 1:10000)에 따라 정자침입율과 다정자침입 그리고 전핵형성의 차이를 조사하였던 바, 수정시 난자당 정자의 수가 증가할수록 정자침입율, 다정자침입 그리고 난자에 침입한 평균 정자 수는 함께 증가하는 것으로 나타났다. 그러나, 전핵형성율은 난자당 정자의 수가 1:6000과 1:6650에서 높게 나타났다. 이상의 결과는, 돼지 난포란의 체외수정시 정소상체 미부정자를 사용했을 때, 50% 이상의 형태학적 정상정자를 가진 정자를 사용하면 동결 융해된 정자와 유사한 수정율을 얻을 수 있었으며, 정자의 형태학적 평가는 좀더 효율적인 수정능획득을 위해 선행되어져야 한다는 것을 시사한다고 하겠다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제21권2호
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• pp.101-107
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• 2006

본 연구는 돼지 수정란의 체외 성숙 및 체외 배양액의 retinol 첨가 효과를 규명하기 위하여 체외 성숙 및 체외 배양액에 retinol을 첨가하여 수정란의 체외 발달에 미치는 영향을 구명하고자 수행되었다. 체외 성숙 배양액에 retinol을 첨가한 결과 성숙율은 $66.7{\pm}6.0{\sim}69.2{\pm}5.3%$으로 각 처리구 간의 유의적인 차이가 없었다(p>0.05). 체외 수정 후 배반포로의 발달율은 $5{\mu}M$ 첨가구에서 $20.4{\pm}2.6%$의 발달율을 나타내어 타 처리구에 비하여 유의적으로(p<0.05) 높게 나타났으며, $10{\mu}M$ 첨가구에 있어서는 분할율과 배반포로의 발달율이 타 처리구에 비하여 유의적으로(p<0.05) 낮게 나타났다. 정상 수정율은 $59.3{\pm}9.6{\sim}73.0{\pm}7.3%$로 처리구간에 차이가 없었다. 다정자 침입율은 처리군 간에 유의차는 인정되지 않았다(p>0.05). 배반포로의 발달 후 세포수를 비교한 결과 대조구($29.8{\pm}1.0$)에 비해 $5{\mu}M(37.0{\pm}1.6)$ 첨가구에서 유의적으로(p<0.05) 많은 세포수를 나타내었다. 체외 배양액에 retinol을 첨가한 후 발달율을 조사한 결과, 난할률, 상실배 및 배반포로의 발달율에서 모두 효과를 나타내지 못하였으며, 특히, $10{\mu}M$의 처리구에서는 대조구를 비롯한 타 처리구들보다 유의적으로(p<0.05) 발달율이 낮게 나타났다. 체외 성숙 배지와 체외 배양액 모두 retinol을 첨가한 결과 배반포로의 발달율에 있어서 각 처리구간의 유의적인 차이는 없었다. 이상의 결과를 종합할 때, 돼지 체외 성숙 배양액에 5 uM의 retinol의 첨가는 발달율과 세포수에 있어서 유의적으로(p<0.05) 효과적이었으며 10uM에서는 유해한 결과를 나타내었다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제28권2호
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• pp.119-126
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• 2004

본 실험은 돼지체외수정란을 생산하는데 적합한 배양액과 산소조건을 구명하기 위하여 NCSU(North Carolina State University)-23, PZM(Porcine Zygotes Medium)-3, PZM-4 및 TCM(Tissue Culture Medium)-199 배양액과 5% 산소조건(39, 5% $O_2$, 5% $CO_2$ , 90% $N_2$ 및 포화습도) 및 20% 산소조건(39, 5% $CO_2$ 및 포화습도)에서 돼지 미성숙난포란의 체외성숙과 체외배발달을 실시하였다. 본 연구에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 돼지 난포란을 5 및 20% 산소조건하에서 NCSU-23, PZM-3, PZM-4 및 TCM-199 배양액에 44시간 동안 성숙을 유도한 결과 난핵포붕괴율과 핵성숙률에 있어서 산소조건 및 배양액간 유의적(p>0.05)차이는 없었다. 2) 체외수정을 실시한 결과 정자 침투율, 자ㆍ웅전핵형성률, 다정자 침입률 및 평균정자수에 있어서 산소조건 및 배양액간에 유의적인 차이가 없었다. 3) 체외수정을 실시한 후, 5 및 20% 산소조건의 NCSU-23, PZM-3, PZM-4 및 TCM-199 배양액에서 배양하여 배발달에 미치는 영향을 조사한 결과, 난할률에 있어서는 유의적(p＜0.05)인 차이가 없었으며. 배발달 7일째 배반포기 발달률에 있어서 5% 산소조건에서는 PZM-3 배양액이, 20% 산소조건에서는 NCSU-23 배양액이 유의적(p＜0.05)으로 높은 결과를 나타냈다. 4) 배발달 7일째 배반포기 배의 세포수를 조사한 결과, 내부세포괴세포수와 총세포수는 산소조건과 배양액간에 통계적인 유의성이 인정되지는 않았으나, 5% 산소조건에서 PZM-3 배양액(36.8$\pm$6.5개)이 다소 높은 총세포수를 나타냈다. 위의 결과를 종합하면 돼지체외수정란의 생산에는 5% 산소조건에서 PZM-3 배양액에서 배발달을 유도하는 것이 배반포기 발달률과 세포수에 있어 효과적이라고 판단된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권1호
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• pp.17-23
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• 2002

본 연구는 지금까지 돼지 난포란 성숙을 위해서 많이 사용하고 있는 mTCM-199, mWaymouth MB 752/1 그리고 NCSU-23 성숙배지를 비교하고 액상정액을 이용한 체외수정 방법을 개발하고자 실시하였다. 미성숙 난포란은 0.5 $m\ell$의 성숙배지에 각 well 당 30~40개씩 적하하였고, 38.5$^{\circ}C$, 5% CO2, 95% 공기로 조절된 CO2 배양기에서 44시간 성숙 시켰다. 미성숙 난포란을 mTCM-199, mWaymouth MB 752/l 그리고 NCSU-23 성숙배지에서 44시간 배양한 결과 CVBD 발생율은 각각 95.6, 94.1 그리고 94.9%였으며, MH단계까지의 성숙율은 각각 92.5, 90.1 그리고 91.1%였다. 성숙배지별, GVBD 발생율과 MH까지의 성숙율간에 유의성은 인정되지 않았다. 액상정액의 제조용 정액은 90% 이상의 운동성을 가진 농후정자부분을 사용하였으며 정액 채취 후 2시간 동안에 22~24$^{\circ}C$의 실온까지 냉각시켰다.실온까지 냉각한 정액은 BTS 희석액으로 2$\times$$10^{8}$ $m\ell$ 정자농도로 조정하여 100 $m\ell$ 플라스틱병에 30 $m\ell$씩 주입하여 17$^{\circ}C$에서 5일간 보관하였다. 5일 보관 후 운동성이 70% 이상인 정자를 체외수정에 이용하였다. 성숙 후 cumulus cell들이 제거된 성숙난포란은 0.5 $m\ell$의 mTCM-199 또는mTBM 수정배지에 30~40개씩 적하하고, 최종정자농도를 2$\times$$10^{6}$$m\ell$되도록하여 6시간 동안 수정시켰다. 체외수정시킨 수정란들은 0.5 $m\ell$의 NCSU-23 배양배지에서 수정 후 6시간 배양하여 정자침입율, 다정자침입율 그리고 웅성전핵형성율을 조사하였고, 수정 후 45시간 배양하여 난할율을 조사하였다. NC-SU-23 성숙배지와 mTBM 수정배지를 이용하였을때 웅성전핵형성율이 48.0%로써 mTCM-199 성숙배지와 수정배지 또는 mWaymouth MB 752/1 성숙배지와 mTCM-199 수정배지를 이용하였을 때보다 웅성 전핵 형성율이 높았다. 2~4세포기까지의 난할율은 mTCM-199 성숙, 수정 및 배양배지에서 24.1%, mWaymouth 752/1 성숙배지, mTCM-199 수정 및 배양배지에서 43.6%, 그리고 NCSU-23 성숙배지, mTBM 수정배지 및 WCSU-23 배양배지를 이용한 것이 71.2%였다. 이상의 결과를 종합하면 BTS 희석액으로 17$^{\circ}C$에서 5일 보존한 액상정액으로 체외수정이 가능함을 입증하였고, NCSU-23 성숙배지, mTBM 수정배지 및 NCSU-223 배지가 미성숙 난포란의 성숙, 수정 및 배양에 우수한 배지임을 입증하였다.