• KSBB Journal
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• 제10권5호
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• pp.533-539
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• 1995

재조합 대장균에 의해 생합성된 PHB를 분리정제하기 위하여 박테리오파아지의 세포파괴작용을 이용하는 방법의 가능성에 대해 알아 보았다. 먼저, $cI_{857}$ 유전자를 지난 박테리오파아지 A를 대장균에 감염시킨 후 lysogen, XLl-Blue($\lambda$HL1)를 선별하고, 이 균주에 PHA 생합성 플라스미드를 도입시켜 원하는 균주인 XLI-Blue($\lambda$HL1, pSYLl05)를 만들였다. 숙주인 XLl-Blue, 열적유도에 의해 세포파괴가 가능한 XLl-Blue($\lambda$HL1), 그리고 세포파괴와 PHB 생합성이 모두 가능한 XLl-Blue(AHL1, pSYL105) 에 대하여 여러 가지 조건에서의 실험결과를 비교.검토하였다. XLI-Blue($\lambda$IL1, pSYLl05)의 경우 대수기에서는 열적유도만으로 세포파괴를 효과적으로 야기할 수 있었으나 PHB가 축적되는 정지기에서는 열척유도만으로 세포파괴를 일으킬 수 없었다. 세포 파괴를 보다 용이하게 하기 위하여 열적유도 빛 2% (v/v)의 chloroform을 사용하는 화학적용균을 병행 하였는데, 이 경우 세포파괴가 효과적으로 일어남을 관찰할 수 있었다.

• Journal of Microbiology
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• 제40권1호
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• pp.20-25
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• 2002

An extracellular PHB depolymerase was purified from P. simplicissimum LAR13 cultural medium by Sepharose CL-6B chromatography. When the fungus was grown in a basal salt medium with poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) as the sole carbon source, PHB depolymerase production reached maximum at its stationary phase. The mycelial growth rate was higher at 37$^{\circ}C$ than at 30$^{\circ}C$ and even higher than at 25$^{\circ}C$, However, the enzyme production was lower at 37$^{\circ}C$ than 30$^{\circ}C$ or 25$^{\circ}C$. The isolated enzyme is composed of a single polypeptide chain with a molecular mass of about 36 kDa as determined by SDS-PAGE. The optimum conditions for the enzyme activity are pH 5.0 and 45$^{\circ}C$. The enzyme was stable for 30 min at a temperature lower than 50$^{\circ}C$, and stable at pH higher than 2.0 but it was unstable at pH 1.0.1 mM Fe$\^$2+/ reduced the enzyme activity by 56% and the enzyme was inhibited almost completely by 4 mM Fe$\^$2+/ . The enzyme was partially inhibited by phenylmethylsulfonyl fluoride and was very sensitive to diazo-DL-norleucine methyl esters dithiothreitol and mercuric ion. However, N-p - tosyl - L - Iysinechloromethyl ketone, p -hydroxymercuricbenzoate and N- acetylimidazole had no influence upon its activity.

• KSBB Journal
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• 제14권4호
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• pp.422-428
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• 1999

Alcaligenes latus 유래의 phbC 유전자를 A. eutrophus에 재도입시킨 형질전환균주를 이용하여 높은 4HB 몰분율을 갖는 P(3HB-4HB)의 고농도 생산을 시도하였다. 형질전환균주는 총균체량, P(3HB-4HB) 농도, 그리고 축적률에서 모균주에 비해 다소 증가한 반면 P(3HB-4HB)내의 4HB 몰분율은 23.5 mol%로 모균주의 12.3 mol%에 비해 현저히 증가하였다. 이는 phbC유전자의 증폭으로 인해 해당과정에서 생성된 3HB와 전구물질인 ${\gamma}$-butyrolacton에서 전환된 4HB의 중합반응이 촉진되기 때문으로 사료된다. 또한 ${\gamma}$-butyrolacton의 농도 $Mg^{2-}$ 이온, 그리고 citrate 첨가량이 P(3HB-4HB)의 농도, 축적률, 그리고 4HB 몰분율에 미치는 영향을 검토하였다. P(3HB-4HB)내의 4HB 몰분율을 증대시키기 위하여 일반적으로 사용되는 2단계 배양법을 변형시켜 ${\gamma}$-butyrolacton과 citrate의 첨가시기를 늦춘 2단계 배양법을 활용하여 P(3HB-4HB)내의 4HB 몰분율을 61.0 mol%로 증가시킬 수 있었다. 또한 ${\gamma}$-butyrolacton의 첨가량을 조절하여 P(3HB-4HB)내의 4HB 몰분율이 92.0 mol%에 이르는 homopolymeric P(4HB)를 생산할 수 있었으며, 그 구조를 $^1$H-NMR을 통해 확인하였다.

• 생명과학회지
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• 제29권1호
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• pp.76-83
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• 2019

본 연구에서는 생분해성 고분자인 poly(3-hydroxbutyrate) (PHB)의 생산 비용 절감을 위해, 탄소원으로 폐식용유(waste frying oil, WFO)을 사용하여 분리 균주 Pseudomonas sp. EML2의 최적 생장 및 PHB 생합성 조건을 확립하였다. WFO와 새 식용류(fresh frying oil, FFO)의 지방산을 분석한 결과 FFO의 지방산 함량은 불포화지방산 82.6%, 포화지방산 14.9%를 차지하는 것으로 나타났으나 WFO의 경우 불포화지방산 56.3%와 포화지방산 33.5%로 FFO와 비교할 때 지방산 조성의 변화를 확인할 수 있었으며, 이러한 불포화지방산의 조성 변화는 가열, 산화반응 및 가수분해에 의한 화학적, 물리적 특성의 변화 때문인 것으로 사료된다. 분리 균주 Pseudomonas sp. EML2의 최대 건조세포중량과 PHB 생합성량(g/l)을 확인하기 위해 플라스크를 이용하여 탄소원 농도, 질소원 종류 및 배양 pH와 온도 및 시간을 확립하였다. 그 결과 30 g/l의 WFO과 0.5 g/l의 $NH_4Cl$를 질소원으로 사용하여 pH 7 및 $20^{\circ}C$의 배양 조건에서 96시간 배양 시 최적의 건조세포중량과 PHB 생합성량을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 3 l jar fermenter를 이용하여 Pseudomonas sp. EML2의 생장 및 PHB 수율을 확인하였다. 그 결과 30 g/l의 WFO를 단일 탄소원으로 사용하여 96시간 배양 시 3.6 g/l의 건조세포중량을 얻었으며 73.0 wt%의 PHB 축적률을 확인하였다. 이 경우 PHB 생합성량 2.6 g/l로 나타났다. FFO를 대조군으로 사용하여 대량배양 한 결과 WFO를 사용한 경우와 비슷한 건조세포중량(3.4 g/l), PHB 축적률(70.0 wt%), 그리고 PHB 생합성량(2.4 g/l)을 확인하였다. 본 연구에서 분리한 Pseudomonas sp. EML2는 WFO를 효과적으로 이용하여 PHB를 생합성 하였으며 이 균주와 WFO는 PHB의 산업적 생산을 위한 새로운 생산 후보자 및 탄소원으로서 이용될 수 있음을 확인하였다.

• KSBB Journal
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• 제13권2호
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• pp.187-194
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• 1998

For mass production of polyhydroxyalkanoates (PHA), high cell density cultures of Alcaligenes eutrophus by fed-batch culture under phosphate-limitation condition has been investigated. PHA accumulation by the regulation by the regulation of initial phosphate concentration could be automatically induced, and high density cell culture above 200 g/L also could be successfully produced. The production of Poly-$\beta$-hydroxybutyrate (PHB) and dry cell weight increased with increasing the initial phosphate concentration. When the initial concentrations of phosphate were in the ranges of 1.5~4.5 g-PO$_4$/L, PHB and dry cell weight obtained were 83~266 g/L and 61~216 g/L, respectively, and PHB productivity was in the ranges of 1.35~3.10 g/L.h. When a mixture of glucose and propionic acid is used as carbon sources, poly(3-hydroxybutyrate-co-poly-3-hydroxyvalerate), P(3HB-co-3HV), could be also successfully produced under phosphate limitation condition. When the mole ratio of propionic acid to glucose in the feeding solution is 0.22, a final dry cell weight of 150 g/L and a P(3-HB-co-3HV) of 90 g/L were produced. Morphological changes and size distribution of PHB granules synthesized in A. eutrophus under phosphate-limitation condition are determined by TEM during the course of fed-batch. Mean granule diameters of PHB produced are in the range of 0.36~0.39 $\mu$m, and mean cell size was elongated from 0.54~0.59 $\mu$m$\times$ 1.3~1.5 $\mu$m to 0.83~0.89 $\mu$m $\times$2.0~2.3 $\mu$m. Phosphate concentration in media did not affect size distribution of PHB granule and cell.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2001년도 추계학술발표대회
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• pp.731-734
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• 2001

An efficient fermentation strategy for the high level production of ultra-high-molecular weight poly(3-hdyroxybutyrate) (PHB) was developed. Although the cell and PHA concentrations obtained by flask cultures at different initial pH (6.0 or 6.9) were almost same level, the molecular mass of PHB produced were quite different along with the initial pH. When a recombinant Escherichia coli XL1-Blue harboring pJC2 containing the Alcaligenes latus PHB biosynthesis genes was cultivated in flask culture (pH 6.0), the PHB having a very high molecular weight of 22 MDa could be produced while only below 1 MDa at initial pH 6.9. The ultra-high-molecular weight PHB could be synthesized to high concentration of 89.8 g/L resulting in the PHB productivity of 2.07 g/L-h by simple fed-batch culture. In this study, we report that PHB having various molecular mass can be produced by employing metabolically engineered E. coli strains harboring the plasmids of different copy numbers containing the A. latus phbCAB genes.

• 생명과학회지
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• 제18권12호
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• pp.1625-1630
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• 2008

본 연구는 생분해성 플라스틱인 poly-${\beta}$-hydroxybutyrate (PHB)의 생산단가를 낮추기 위한 노력으로 저가의 기질로부터 PHB 대량생산을 위한 기초자료를 얻는데 그 목적을 두었다. Hemicellulose hydrolysate는 지구상에 풍부하게 존재하는 저가의 waste by-product로서 xylose가 많이 포함되어 있다. 본 연구에서는 xylose로부터 PHB를 생산할 수 있는 균주를 토양에서 분리하여, 분류학적 위치를 밝히고, 균체 생육 최적 조건, PHB 생산을 위한 최적 발효 배양 조건, PHB의 구조 확인 등을 검토 하였으며, 그 결과는 다음과 같다. 토양으로부터 분리한 균주 J-65는 형태학적, 배양적, 생화학적 및 partial 16S rRNA sequence에 근거하여 Bacillus megaterium로 동정하였다. B. megaterium J-65의 균체 생육 최적 조건은 온도 $37^{\circ}C$, 초발 pH 8.0이었으며 2% xylose, 0.25% $(NH_4)_2SO_4$, 0.3% $Na_2HPO_4{\cdot}12H_2O$, 0.1% $KH_2PO_4$였다. PHB 축적에 영향을 미치는 요인을 검토하기 위해 균체생육 최적배지에서 $37^{\circ}C$, 24시간 1차 배양한 후, 균체를 회수하여 각종 영양분이 결핍된 배지에 2차 배양을 실시한 결과 B. megaterium J-65는 균형생육조건(balanced-growth condition)에서 PHB를 합성하는 균주로 나타났다. PHB보다 물성이 향상된 PHB/HV 공중 합체를 생산하기 위하여 보조기질로 propionic acid를 첨가하였을 때, 0.1% propionic acid 농도에서 HV mol%가 14%인 PHB/HV 공중합체가 합성되었다. 5 l 용량의 발효조에 B. megaterium J-65를 회분배양하였을 때 배양 21시간에 건조균체량 10 g/l, PHB 3.5 g/l를 얻을 수 있었고, 유가배양을 실시한 결과 배양 48시간에 건조균체량 26.52g/l, PHB 9.28 g/l를 얻을 수 있었다. 생산된 PHB를 alkaline solution 처리와 chloroform을 이용한 유기용매 추출법을 이용하여 추출.정제한 후 Gas Chromatography로 정제를 확인하고 300MHz 1H-NMR을 실시한 결과 3-hydroxybutyrate의 homopolymer임을 확인하였다.

• 미생물학회지
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• 제39권2호
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• pp.76-82
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• 2003

Alcaligenes faecalis T1의 Poly(3-hydroxybutyrate)(PHB) depolymerase활성 증진을 위해 DNA shuffling방법을 이용하였다. 제조된 A. faecalis T1의 PHB depolymerase 돌연변이 유전자의 library를 Pseudomonas syringae의 icenucleation protein유전자를 포함하는 발현벡터 pJHCll에 클로닝하여 약 7,000개의 형질전환체를 얻었다. 탄소원으로 PHB또는 poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)를 포함하는 M9최소배지를 이용하여 형질전환체들로부터 활성이 서로 다른 돌연변이주들을 선별하였다. 이들의 PHB depolymease 활성은 평판배지에서의 halo형성 및 배양 상등액을 이용한 탁도 감소 실험으로 확인하였으며,형질전환체들 중에서 shuffling전의 대조군에 비하여 사용된 기질에 따라 효소활성이 1.8-3.2배 증진된 II-4 돌연변이주를 얻었다. DNA 염기서열의 분석을 통하여 II-4의 PHB depolymease에는 3개의 아미노산 치환(A1a209Va1, Leu258Phe, Asp263Thr)이 이루어졌음을 확인하였다. 여러 가지 돌연변이주의 아미노산 서열의 변화를 분석한 결과, PHB depolymerase의 catalytictriad주위에 기존 아미노산에 비하여 보다 소수성인 아미노산으로의 치환이 소수성 기질인 PHB에 대한분해 활성 중진에 기여하는 것으로 추정되었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제11권6호
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• pp.1031-1037
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• 2001

By a sequential action of ${\beta}$-ketothiolase and acetoacetyl-CoA reductase, two molecules of acetyl-CoA re converted into D-3-hydroxybutyryl-CoA, a substrate for PHB synthase to form poly-3-hydroxybutyryl-CoA, a substrate for PHB synthase to form poly-3-hydroxybutyrate (PHB) of rhodobacter sphaeroides. The ${\beta}$-ketothiolase gene, phbA, and acetoacetyl-CoA reductase gene, phbB, were cloned and analyzed for their expression. Enzyme activities of ${\beta}$-ketothiolase and acetoacetyl-CoA reductase showed constitutive levels during aerobic and photoheterotrophic growth of R. sphaeroides. In addition, no difference of each enzyme activity was observed between cells grown aerobically and photoheterotrophically. The constitutive level of the enzyme activities are regulated according to the growth phases along with growth conditions. Thus, phbAB expression is not determinative in regulating the PB content. On the other hand, phbA-deleted cell AZI accumulated only $10\%$ PHB of the wild-type, and an elevated dosage of phbAB in trans in R. sphaeroides resulted in a higher content of PHB, indicating that phbAB codes for the enzymes responsible for providing the main supply of subsyrate for PHB synthase. PHB formation by an alternative pathway that does not does not depend on the phbA-and phbB-coding enzymes is also proposed.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제8권6호
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• pp.714-718
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• 1998

Various mutants either lacking or having decreased levels of light-harvesting complexes and reaction center complex were obtained with a high frequency by an increased formation of poly-3-hydroxybutyrate (PHB) in Rhodobacter sphaeroides. One of the photosynthesis-defective mutants, PY-17, which was devoid of any of the light-harvesting complexes (B800-850, B875) as well as the reaction center complex, was analyzed further. The mutant showed substantial transcription of the puhA, pufKBALMX, and pucBAC operons coding for the structural proteins of the photosynthetic complexes although each of the activities was lower than that of the wild type. Translation of the pufKBALMX and pucBAC operons were also active in the mutant although with activities different from the corresponding one of the wild type. From these results the mutation appears to exert its effect at the post-translational level of the photosynthetic complex assembly. Complementation of the photosynthesis-defective phenotype of the mutant was achieved with an about 12-kb DNA region containing the puhA gene. The relationship between the formation of PHB and photosynthetic complexes is discussed.