Bifidobacteria의 효과적인 이용을 위해서는 산소에 내성을 갖는 균주를 선발하는 연구 외에도 산소 스트레스에 대한 방어 기작에 대한 기초적인 연구가 필요하다. 인체로부터 분리된 산소 내성 bifidobacteria는 산소제거활성을 가지고 있었으며 이는 열처리 및 극단적인 pH(pH 2.0)하에서 산소제거활성이 소실되는 것으로 보아 효소가 관여 할 가능성을 확인하였다. 또한 산소제거활성을 보이는 주된 효소를 탐색해본 결과 NADH를 공급하였을 때만 산소제거활성을 보여 NADH oxidase가 주된 역할을 하는 효소임을 알 수 있었다. 또한 산소 내성 균주는 높은 NADH peroxidase 활성을 보유한 것으로 보아 NADH oxidase의 작용에 의해 생성되는 $H_2O_2$는 NADH peroxidase에 의해 무독화 되는 것으로 판단되었다. 배양 중 산소를 공급하여 산소스트레스를 주었을 경우 NADH oxidase와 NADH peroxidase 활성이 1시간 이내에 급격히 증가하였고 산소 공급 후 2시간 동안 배양액 중 용존 산소가 크게 증가하지 않았다. 산소공급 후 2시간 이상이 경과하면 NADH oxidase와 NADH peroxidase활성이 감소하고 용존 산소가 급격히 증가하였고 산소스트레스에 대한 방어 체계가 붕괴되는 현상이 관찰되었다. 즉, 산소 내성 bifidobacteria는 일정 한계까지는 환경중의 산소를 NADH oxidase로 제거하고 생성되는 $H_2O_2$는 NADH peroxidase에 의해 제거시키는 방어 체계를 갖고 있음을 알 수 있었다.
식물세포배양으로부터 peroxidase를 대량 생산하기 위한 분리/정제 공정 으로서 세포를 파쇄하고 크로마토그래피 전처리로서 활성백토를 적용하였다. 활성백토는 미세한 세 포 조각 뿐만 아니라 여려가지 불순불을 선택적으로 흡착 하는 성질을 나타내었으며, 이를 통하여 효과적으로 정제 공정을 진행할 수 있었다 흡착을 통한 전처리 후 한외여 과장치를 이용하여 농축을 실시 하였으며, DEAE-Sepharose F FF를 이용한 크로마토그래피를 통해 정제가 이루어졌다. 활성을 나타내는 용액을 탈염, 농축 후 동결 건조하였다. 이 공정은 상업화에 필요한 대량 정제를 가능하게 하였으며 수율과 정제비용 측면에서 상당히 경제적인 공정임을 입증하였다, 활성백토를 이용한 흡착공정은 다른 효소 및 단백질의 경제적인 대량정제에 적용될 수 있으리라 기대된다.
동물성 mucin은 인체 타액 mucin과 유사한 구조적 특성을 가지고 있으므로 효과적인 타액대체제의 개발에 적합한 성분으로 여겨져 왔다. 구강건조증 환자가 동물성 mucin 함유 타액대체제를 사용할 경우, 동물성 mucin과 인체 타액에 존재하는 항균 단백질이 용액상태인 전타액과 구강표면에 형성된 pellicle에 동시에 존재할 수 있으므로 이들 물질사이에 상호작용이 일어 날 수 있을 것이다. 본 연구의 목적은 용액과 hydroxyapatite(HA) 표면에서 동물성 mucin이 peroxidase 활성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 시행되었다. 동물성 mucin이 peroxidase 활성에 미치는 영향은 돼지의 위장 mucin(porcine gastric mucin, PGM) 이나 소의 악하선 mucin(bovine submaxillary mucin, BSM)을 소의 lactoperoxidase(bovine lactoperoxidase, bLPO)나 타액검체와 incubation하는 방법을 사용하여 분석하였고, 표면상태에서의 연구를 위해 HA beads, HA disc, 소의 치아와 같은 3가지 종류의 HA 표면을 활용하였다. Peroxidase 활성은 NbsSCN 법을 이용하여 분석하였다. 1. 돼지위장 mucin은 용액상태에서 bLPO 활성을 증가시켰으나 타액검체의 peroxidase(peroxidase in saliva sample, POS) 활성에는 영향을 미치지 않았다. 2. 소 악하선 mucin은 용액상태에서 bLPO와 POS 활성에 영향을 미치지 않았다. 3. HA 표면에 부착된 돼지위장 mucin은 peroxidase의 부착과 활성을 증가시켰고 이러한 효과는 세 종류의 HA 표면 모두에서 일어났으며, POS의 활성증가는 HA beads와 소 치아 표면에서만 나타났다. 4. bLPO와 돼지위장 mucin의 혼합물을 HA 표면에 부착시킬 경우, HA beads와 HA disc 표면에서의 peroxidase 활성은 증가하였다. 5. bLPO의 돼지위장 mucin에 대한 부착친화도는 소 악하선 mucin에 비해 컸다. 이상의 결과를 종합해 볼 때 동물성 mucin은 용액상태와 HA 표면에서 peroxidase 활성에 영향을 미침을 알 수 있으며, 동물성 mucin을 포함하고 있는 타액대체제는 인체타액 및 타액대체제에 있는 peroxidase 활성에 영향을 미칠 수 있을 것이다.
감마선에 조사된 흰쥐의 신장 내의 효소활성에 홍삼 추출물이 어떠한 영향을 미치는지를 연구하고자 생후 5주령의 생쥐를 4군으로 분류하여 감마선 조사 및 홍삼 추출물 투여 혹은 생리적 식염수를 투여하고 그로부터 1일, 2일, 3일, 4일 및 5일 등 5회에 걸쳐 도살하여 신장을 취하고 신장조직 내의 SOD, peroxidase 및 catalase 등의 활성도를 측정하였다. 그 결과 홍삼 추출물 투여군은 대조군에 비하여 SOD나 catalase 및 peroxidase의 활성이 유의성있게 증가하다가 회복하였으며 감마선 조사 후 생리적 식염수 투여군은 대조군에 비하여 SOD, peroxidase 및 catalase의 활성이 증가하다가 감소하는 경향이었다. 감마선 조사후 홍삼 추출물 투여군은 SOD, peroxidase 및 catalase의 활성도가 감마선 조사 후 생리적 식염수 투여군에 비하여 보다 빠르게 회복되는 경향이었다. 그러므로 홍삼 추출물이 이온화 방사선 조사 후 장해로 일어나는 SOD, peroxidase 및 catalase 활성도의 변화에 회복효과가 있음이 나타났다.
본 연구에서는 peroxidase 활성의 신속한 스크리닝을 위해 peroxidase의 활성을 정량적으로 평가할 수 있는 분석으로 agar plate와 96-well plate에서 peroxdase의 활성에 비례하여 색상감도를 측정할 수 있는 colorimetric 분석법을 개발하였다. 이 방법은 RP-HPLC 결과와 매우 비례적으로 상관적인 결과를 보였다. 이 colorimetric 분석법을 사용하여, 폐수에서 한천 고체배지에서 7회에 걸친 스크리닝으로 높은 농도의 2,4-DCP(1000 ppm)에서 생존하는 균주를 스크리닝하였고 선별된 이들 균주들은 탄소원으로 2,4-DCP 만을 대사할 수 있으며 높은 peroxidase 생산량을 보였다. 분리된 균주들 중 높은 peroxidase 활성을 가지는 2,4-DCP 분해 균주를 분리하였고 최종 분리된 균주는 염색폐수의 COD를 4시간 동안 44%에서 61%까지 제거하였다. 상기의 결과에 의해 본 연구에서 개발된 발색법이 페놀화합물 분해 균주 스크리닝법이 빠르고 쉬운 난분해성 물질인 페놀 혼합물의 분해 균주 탐색에 대하여 성공적으로 적용될 수 있기를 기대한다.
콩나물 줄기로부터 추출, 정제한 peroxidase는 glucose oxidase와 함께 guaiacol을 기질로 사용하여 포도당의 분석에 사용되었다. peroxidase는 DEAE-Sephacel ion exchange column chromatography를 통해 얻은 분획이 조효소액에 비해 specific activity가 10.8배 증가되었고 수율은 11.3%였다. 정제된 peroxidase와 glucose oxidase를 이용한 포도당 분석의 최적 pH는 5.5였고 최적온도는 $40^{\circ}C$로 나타났으며 포도당 양의 증가에 따라 효소활성은 증가되었으며 반응시간과의 관계에서도 직선을 보여 주었다. 그리고 L-cysteine과 dithiothreitol과 같은 환원제는 포도당 분석에 이용되는 glucose oxidase와 콩나물 peroxidase의 활성을 저해하는 것으로 나타났다.
벼 품종의 관수저항성 관련 특성을 검토코자 24일묘를 3일간 관수처리하여 뿌리와 엽신의 POD 비활성도 및 POD 동위효소들을 PAGIF법으로 전기영동하여 본 결과 관수저항성이 상대적으로 약한 일본형품종들은 통일형이나 인도형품종들보다 POD 비활성도가 높았으며 또한 관수처리로 일본형품종들의 엽신부에서는 무관수시 어느 부위에서도 나타나지 않았던 POD 동위효소의 특이 band가 등전점 9부근에서 출현하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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