토양으로부터 nucleoside oxidase 생산균주를 분리하고 Flavobacterium meningosepticum으로 동정하였다. 생산균주의 cell free extract로부터 본 효소를 정제배율 180배, 수율 18로 전기영동적으로 균일하게 정제하였으며 정제효소의 기질 특이성을 검토한 결과 nucleoside만을 산화시키는 전형적인 nucleoside oxidase이었다. Adenosine을 기질로 한 표준효소반응계에서 stoichiometry를 검토한 결과 본 효소는 lmol adenosine을 중간 생성물인 adenosice 5'-aldeh-yde로 산화 후 1 mol adenosine 5'-carboxylic acid까지 2단계로 산화시키면서 동시에 2 mol H2O2를 생성하는 새로운 type의 nucleoside oxidase로 확인되었다. 본 효소의 높은 기질 특이성과 H2O2를 생성하는 반응성은 nucleoside의 신속 간편한 효소학적정량볍 및 임상진단용 시약의 개발에 응용될 수 있음을 시사하였다.
This study was undertaken to investigate the effect of Taraxacum herba extract on the hepatic xanthine oxidase activity as a oxygen free radical generating enzyme in vitro and in vivo. It was observed that partial purified hepatic xanthine oxidase (type O) activity was strongly inhibited by the addition of Taraxacum herba n-butanol extract in vitro. The Km value of xanthine oxidase without affecting the Vmax value for xanthine was significantly increased by the addition of ta-dase (type O) activity was significantly inhibited by the treatment of Taraxacum gerba n-butanol ex-tract for 5days(over 40mg/kg, i.p), whereas, xanthine oxidase (type D) activity was not changed by the injection of Taracacum herba n-butanol extract. Meanwhile, liver weight / body weight(%), serum alanine aminotransferase activity and hepatic lipid peroxide content in Taraxacum herba n-buta-nol extract-treated rat were not changed. These findings led us to conclude that Taraxacum herba n-butanol extract may regulate the hepatic xanthine oxidase type O activity to prevent toxic effect of oxidative stress by the oxygen free radicals.
Cytochrome oxidase was purified from bovine-heart mitochondria and its enzymatic properties were examined. The purified cytochrome oxidase was identified by its absorption spectrum and chromatogram through gel filtration. The specific activity, purification degree and yield of purified cytochrome oxidase were 18 nmol/mg/ml/min, 24.83 fold and 0.93%, respectively. The activity of the enzyme assayed by a ferrocytochrome $c-O_2$ system was optimized at $25^{\circ}C$ and pH 6.5. Examining the effect of nonionic detergents established that cytochrome oxidase was deactivated by Triton X-100. The oxidase was activated by Tween 80 and deactivated by Tween 20. The Michaelis constant and maximum velocity of the oxidase for ferrocytochrome c were 0.032~0.044 mM and 0.019~0.021 mM/min, respectively. After adaption to basal diet for a week, experimental diets containing 6 mg Cu/kg, or zero mg Cu/kg, or 12 mg Cu/kg were fed to a control group, a copper-free group and a copper-rich group of Sprague-Dawley rats, respectively, for 4 weeks. The specific activities assayed for the ferrocytochrome $c-O_2$ system of isolated cytochrome oxidase from the rat liver of control, copper-free, and copper-rich group were 1.00, 1.19, and 0.878 nmol/mg/ml/min, respectively. Their degrees of purification were 11.38, 10.82 and 8.78 fold, respectively. The specific activities for liver and heart mitochondrial cytochrome oxidase of copper-free/copper-rich groups assayed using the ferrocytochrome $c-O_2$ system were 81.4% and 96.4%/64.1% and 61.1%, respectively, compared with those of the control.
우리나라 전통 발효식품(침채류 및 젓갈류)으로부터 cholesterol oxidase 생산성이 있는 균주를 분리하고 이들 분리된 균주들로부터 여러 단계의 균주 선멸시험을 통하여 cholesterol oxidase 생산성이 우수한 미생물을 선별하여 그 특성을 조사하였다. Cholesterol oxidase의 생산성이 가장 우수한 SF041의 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성을 조사하여 Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology의 분류기준에 따라 동정한 결과 Bacillus megaterium 또는 그 유연균으로 동정되어 분리균을 Bacillus megaterium SFO41로 명명하였다. Cholesterol oxidase의 생산 조건을 검토한 결과 최적 배지 조성은 2.0% glucose, 0.5% yeast extact, 0.03% $MgSO_4\;7H_2O,\;0.02%\;K_2HPO_4,\;0.2%\;NH_4NO_3$, 0.2% cholesterol로 판명되었으며, 배영 조건은 $30^{\circ}C$, 초기 pH 7.0, 진탕 속도는 150 rpm에서 24시간 배양 시 효소 생성이 가장 우수하였다(2.37 U).
Bifidobacteria의 효과적인 이용을 위해서는 산소에 내성을 갖는 균주를 선발하는 연구 외에도 산소 스트레스에 대한 방어 기작에 대한 기초적인 연구가 필요하다. 인체로부터 분리된 산소 내성 bifidobacteria는 산소제거활성을 가지고 있었으며 이는 열처리 및 극단적인 pH(pH 2.0)하에서 산소제거활성이 소실되는 것으로 보아 효소가 관여 할 가능성을 확인하였다. 또한 산소제거활성을 보이는 주된 효소를 탐색해본 결과 NADH를 공급하였을 때만 산소제거활성을 보여 NADH oxidase가 주된 역할을 하는 효소임을 알 수 있었다. 또한 산소 내성 균주는 높은 NADH peroxidase 활성을 보유한 것으로 보아 NADH oxidase의 작용에 의해 생성되는 $H_2O_2$는 NADH peroxidase에 의해 무독화 되는 것으로 판단되었다. 배양 중 산소를 공급하여 산소스트레스를 주었을 경우 NADH oxidase와 NADH peroxidase 활성이 1시간 이내에 급격히 증가하였고 산소 공급 후 2시간 동안 배양액 중 용존 산소가 크게 증가하지 않았다. 산소공급 후 2시간 이상이 경과하면 NADH oxidase와 NADH peroxidase활성이 감소하고 용존 산소가 급격히 증가하였고 산소스트레스에 대한 방어 체계가 붕괴되는 현상이 관찰되었다. 즉, 산소 내성 bifidobacteria는 일정 한계까지는 환경중의 산소를 NADH oxidase로 제거하고 생성되는 $H_2O_2$는 NADH peroxidase에 의해 제거시키는 방어 체계를 갖고 있음을 알 수 있었다.
초석잠 메탄올 추출물이 뇌신경전달물질과 관련이 있는 acetylcholine esterase, monoamine oxidase 및 xanthine oxidase의 활성억제효과에 대하여 실험하였다. 실험관내에서 초석잠 추출물을 각각 100 및 200mg/kg씩 첨가한 다음 실험한 결과 첨가농도가 증가할수록 과산화지질의 생성을 억제하여 용량 의존형으로 나타났다. 쥐를 대상으로 20일간 투여한 동물실험에서는 초석잠 추출물 100 mg/kg을 식이에 혼합하여 투여한 결과 지질 과산화의 생성을 억제하였다. Acetylcholine esterase의 활성의 경우 초석잠 추출물을 100 mg/kg 투여한 결과 대조군에 비하여 효소활성이 23.11%로 억제되었고, monoamine oxidase 및 xanthine oxidase 활성이 각각 21.93% 및 63.58%로 억제되었다. 그리고 초석잠 추출물을 100 mg/kg을 투여한 경우 xanthine dehydrogenase로부터 xanthine oxidase로의 형전환비율은 28%로 현저하게 억제되었다. 또한, Xanthine dehydrogenase로부터 oxidase로의 형전환비율을 실험한 결과 정상상태에 비하여 억제됨을 알 수 있었다.
본 연구에서는 산업적으로 사용될 수 있는 안정하고 활성이 높은 cholesterol oxidase를 생산하는 균주를 얻기 위해 토양 미생물로부터 균주를 선별하였다. 선별된 균주에 대하여 세포외 효소 활성을 측정한 결과 BEN 115로 명명한 균주가 가장 높은 효소 활성도를 나타내었다. 이 균주는 형태학적, 생리학적 특성과 배양형태 및 G+C 함량을 분석한 결과 Nocardia속으로 확인되었다. 최적 효소 생산 조건을 조사한 결과 기존 yeast malt extract broth 조성인 0.4% yeast extract, 0.4% glucose, 1% malt extract에서 가장 높은 활성을 나타냈다. 본 균주에서 생산된 extracellular cholesterol oxidase는 SDS-PAGE와 Western blot 결과 분자량이 55, 57 kDa인 두 종류의 효소가 존재하는 것으로 나타났다. BEN 115에 대한 효소학적 특성을 연구한 결과 온도 안정성은 $55^{\circ}C$까지 효소 활성이 유지되었고, pH 안정성은 pH $3.5{\sim}9.5$의 범위까지 안정한 것으로 나타났으며 최적 온도와 최적 pH는 각각 35oC와 pH 5.5인 것으로 나타났다. 또한 detergent(Triton X-100, Triton X-114 그리고 Tween 80) 첨가 시 효소 활성이 첨가하지 않은 대조군보다 약 $1.6{\sim}2.0$배 증가하는 것으로 나타났다. Campesterol, sitosterol 그리고 stigmasterol에 대한 기질 특이성은 cholesterol(100%)과 상대적으로 비교 시 각각 50%, 50% 그리고 27%의 기질 특이성을 나타내었다.
Pichia pastoris의 배양조건과 배지의 탄소원에 따른 alcohol-oxidase의 생성기능과 alcohol-oxidase의 기질특이성을 실험하기 위하여 P. pastoris CBS 2612와 P. pastoris CBM 10의 2균주에 대하여 실험하였다. 배양조건에 따른 효소생성은 glucose를 탄소원으로 첨가한 mineral salt medium에서 균체를 정상기까지 배양하여 methanol이 함유된 배지에서 재배양하는 2단계 배양법의 경우가 균체를 직접 methanol배지에 배양한 경우보다 효율적이었으며 생성된 총효소량도 전자의 경우가 후자에 비해 약 1.7배 정도 많았다. 다음 탄소원에 따른 효소생성능을 비교하였다. 먼저 직쇄alcohol을 탄소원으로 사용한 경우 methanol을 제외한 ethanol, propanol, butanol 그리고 pentanol에서는 효소가 생성되지 않았고 또한 이 직쇄alcohol을 methanol과 혼합한 경우에도 극미량의 생성에 그쳤다. 여러가지 탄소화합물(glucose, xylose, lactose, glycerol, galactose, saccharose, sorbose, lactic acid, acetic acid)을 탄소원으로 사용하면 methanol에 의해 생성된 효소량보다 훨씬 작았으나 이들을 methanol과 혼합 사용하면 효소생성량은 급격히 증가하였고, 특히 xylose, lactose 그리고 lactic acid의 경우는 methanol 단독 사용시보다 오히려 다량 생성되었다. 시험 2균주 중에서도 어떤 경우에서든지 P. pastoris CBS 2612가 alcohol-oxidase 생성능이 더 좋은 것으로 나타났다. 효소의 기질특이성은 효소를 기질에 반응시킬때는 교반을, 그리고 효소 활성측정은 alcohol-oxidase가 methanol을 분해하여 생성한 formaldehyde를 직접 정량 하였을 경우 탄소쇄가 7개 이하인 직쇄alcohols과 불포화alcohols, 그리고 일부2급alcohols(isobutyl alcohol, isoamyl alcohol)에도 특이성이 있었다.
The effects of ethanol and acetaldehyde on monoamine oxidase activity in mouse liver mitochondrial fraction were studied. In vivo, a single dose of ethanol increased the hepatic monoamine oxidase activity compared to control group, and chronic ethanol consumption also increased the enzyme activity using tyramine, benzylamine or serotonin as substrate. Acetaldehyde, the metabolite of ethanol, significantly increased monoamine oxidase activity more than ethanol did. In contrast to the in vivo results, it was found that the monoamine oxidase activity was inhibited in vitro by ethanol or acetaldehyde in the dose-dependent manner.
The NADPH oxidase of phagocytes catalyzes the reduction of oxygen to $O_2^-$ at the expense of NADPH. The enzyme is dormant in resting neutrophils and becomes activated on stimulation. During activation, $p47^{phox}\;(\underline{ph}agocyte\;\underline{ox}idase\;factor)$, a cytosolic oxidase subunit, becomes extensively phosphorylated at a number of serines located between S303-S379. Oxidase activation can also be achieved by the addition of phosphorylated recombinant $p47^{phox}$ by protein kinase C in the cell-free system in the presence of $GTP{\gamma}S$. The cell-free activation is inhibited by wortmannin and LY294002. specific inhibitors of phosphatidylinositol 3kinase (PI 3-kinasel) These results indicate that PI 3-kinase may playa pivotal role in the activation of NADPH oxidase.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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