• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제30권11호
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• pp.1659-1669
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• 2020

1,3-α-3,6-anhydro-L-galactosidase (α-neoagarooligosaccharide hydrolase) catalyzes the last step of agar degradation by hydrolyzing neoagarobiose into monomers, D-galactose, and 3,6-anhydro-L-galactose, which is important for the bioindustrial application of algal biomass. Ahg943, from the agarolytic marine bacterium Gayadomonas joobiniege G7, is composed of 423 amino acids (47.96 kDa), including a 22-amino acid signal peptide. It was found to have 67% identity with the α-neoagarooligosaccharide hydrolase ZgAhgA, from Zobellia galactanivorans, but low identity (< 40%) with the other α-neoagarooligosaccharide hydrolases reported. The recombinant Ahg943 (rAhg943, 47.89 kDa), purified from Escherichia coli, was estimated to be a monomer upon gel filtration chromatography, making it quite distinct from other α-neoagarooligosaccharide hydrolases. The rAhg943 hydrolyzed neoagarobiose, neoagarotetraose, and neoagarohexaose into D-galactose, neoagarotriose, and neoagaropentaose, respectively, with a common product, 3,6-anhydro-L-galactose, indicating that it is an exo-acting α-neoagarooligosaccharide hydrolase that releases 3,6-anhydro-L-galactose by hydrolyzing α-1,3 glycosidic bonds from the nonreducing ends of neoagarooligosaccharides. The optimum pH and temperature of Ahg943 activity were 6.0 and 20℃, respectively. In particular, rAhg943 could maintain enzyme activity at 10℃ (71% of the maximum). Complete inhibition of rAhg943 activity by 0.5 mM EDTA was restored and even, remarkably, enhanced by Ca²⁺ ions. rAhg943 activity was at maximum at 0.5 M NaCl and maintained above 73% of the maximum at 3M NaCl. K_m and V_max of rAhg943 toward neoagarobiose were 9.7 mg/ml and 250 μM/min (3 U/mg), respectively. Therefore, Ahg943 is a unique α-neoagarooligosaccharide hydrolase that has cold- and high-salt-adapted features, and possibly exists as a monomer.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제24권1호
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• pp.48-51
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• 2014

${\alpha}$-Neoagarooligosaccharide (${\alpha}$-NAOS) hydrolase was purified from Cellvibrio sp. OA-2007 by using chromatographic techniques after hydroxyapatite adsorption. The molecular masses of ${\alpha}$-NAOS hydrolase estimated using SDS-PAGE and gel filtration chromatography were 40 and 93 kDa, respectively, and the optimal temperature and pH for the enzyme activity were $32^{\circ}C$ and 7.0-7.2. ${\alpha}$-NAOS hydrolase lost 43% of its original activity when incubated at $35^{\circ}C$ for 30 min. The enzyme hydrolyzed neoagarobiose, neoagarotetraose, and neoagarohexaose to galactose, agarotriose, and agaropentaose, respectively, and produced 3,6-anhydro-L-galactose concomitantly; however, it did not degrade agarose.

• 생명과학회지
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• 제17권11호
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• pp.1601-1604
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• 2007

Agarivorans sp. JA-1 유래의 내열성 ${\beta}-agarase$ 유전자의 분비형 과발현과 재조합효소분해산물의 항균효과를 확인하였다. B. subtilis 168, DB104, ISW1214의 3가지 재조합발현 숙주를 비교하여 ISW1214 균주가 LB배지에서 배양 9시간에 총 효소활성 52,460 U과 비활성 201 U/mg의 최대 발현량을 보이는 것을 확인하였다. 이는 E. coli BL21 균주에 비해 총 효소활성은 약 90배, 비활성은 약 100배 증가한 결과이다. 재조합 ${\beta}-agarase$의 기질로 저가의 한천을 사용하여 neoagarobiose, neoagarotetraose 등 의 neoagarooligosaccharide를 생산하였으며, 생산된 neoagarooligosaccharides는 그람양성 세균인 B. subtilis와 그람음성 세균인 E. coli 모두의 성장을 저해하는 항균활성이 있음을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 생산된 재조합 ${\beta}-agarase$와 재조합 효소의 한천분해 산물은 식품산업 등에 사용가능한 천연 항균제 생산에 활용이 가능할 것으로 기대된다.

• 생명과학회지
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• 제29권2호
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• pp.158-163
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• 2019

이 연구의 목적은 agarase를 생산하는 새로운 해양 박테리아를 분리하는 것이다. Agarase는 agarose를 가수분해하여 다양한 생리활성을 가지는 agarooligosaccharides 또는 neoagarooligosaccharides를 생성할 수 있다. 전라남도의 여수연안에서 채취한 해수로부터 DH-3 균주를 분리하였다. DH-3 균주는 16S rDNA 서열분석을 통하여 Persicobacter sp. DH-3로 명명하였다. 세포 외로 분비된 효소는 Persicobacter sp. DH-3의 배양액으로부터 얻었으며, 특성연구에 사용하였다. 20, 30, 40, 50, 60 및 $70^{\circ}C$에서의 온도별 상대활성은 각각 50, 55, 70, 100, 90 및 50%였다. pH 5, 6, 7 및 8에서의 pH별 상대활성은 각각 75, 100, 90, 75%였다. 본 효소는 20 mM Tris-HCl 완충액에서 pH 6.0 및 $50^{\circ}C$에서 최대활성을 나타내었다. 본 효소는 한천이 액체상태로 존재하는 $50^{\circ}C$에서 최대활성을 나타내었으므로 산업적으로 유용한 효소로 판단된다. 본 효소는 20, 30 및 $40^{\circ}C$에서 2시간 동안 열처리하여도 80% 이상의 잔존활성을 보였다. TLC 분석결과, Persicobacter sp. DH-3 균주의 한천분해효소는 네오한천올리고당인 neoagarohexaose와 neoagarotetraose를 생성하였으므로 ${\beta}$-agarase로 확인되었다. Zymogram 분석결과, Persicobacter sp. DH-3는 적어도 45, 70 및 140 kDa 크기의 3종류 이상의 한천분해효소를 생산하는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로, Persicobacter sp. DH-3 유래 agarase는 기능성을 가진 neoagarooligosaccharides의 생산에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

• 생명과학회지
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• 제22권2호
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• pp.266-280
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• 2012

한천은 거대 홍조류의 세포벽 성분으로 agarase에 의해 가수분해된다. Agarase는 분해 양상에 따라 ${\alpha}$-agarase (E.C. 3.2.1.158)와 ${\beta}$-agarase (E.C. 3.2.1.81)로 나눌 수 있으며 아미노산 서열 유사성에 따라 GH (glycoside hydrolase) -16, -58, -86, -96, -118 로 나눌 수 있다. 많은 agarase들이나 그들의 유전자가 바다나 육지 환경의 세균 혹은 메타게놈에서 검출, 분리, 재조합 발현되었다. Agarase의 산물인 한천올리고당(agarooligosaccharides)과 네오한 천올리고당(neoagarooligosaccharides)은 항암, 면역활성, 항산화, 장내유용세균활성화, 간보호, 항균, 미백, 보습의 효과 등 다양한 기능성이 보고되어 식품, 화장품, 의학 영역에서 광범위하게 이용될 수 있다. 또한 agarase는 연구영역에서 이용될 수 있다. 이 논문은 agarase의 검출원, 정제법, 검출법 그리고 응용영역에 대해 검토하였고, 한천대사에서 agarase의 역할, 대사산물의 기능 등도 고찰하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제19권3호
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• pp.257-264
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• 2009

A $\beta$-agarase gene, agaB34, was functionally cloned from the genomic DNA of a marine bacterium, Agarivorans albus YKW-34. The open reading frame of agaB34 consisted of 1,362 bp encoding 453 amino acids. The deduced amino acid sequence, consisting of a typical N-terminal signal peptide followed by a catalytic domain of glycoside hydrolase family 16 (GH-16) and a carbohydrate-binding module (CBM), showed 37-86% identity to those of agarases belonging to family GH-16. The recombinant enzyme (rAgaB34) with a molecular mass of 49 kDa was produced extracellularly using Escherichia coli $DH5{\alpha}$ as a host. The purified rAgaB34 was a $\beta$-agarase yielding neoagarotetraose (NA4) as the main product. It acted on neoagarohexaose to produce NA4 and neoagarobiose, but it could not further degrade NA4. The maximal activity of rAgaB34 was observed at $30^{\circ}C$ and pH 7.0. It was stable over pH 5.0-9.0 and at temperatures up to $50^{\circ}C$. Its specific activity and $k_{cat}/K_m$ value for agarose were 242 U/mg and $1.7{\times}10^6/sM$, respectively. The activity of rAgaB34 was not affected by metal ions commonly existing in seawater. It was resistant to chelating reagents (EDTA, EGTA), reducing reagents (DTT, $\beta$-mercaptoethanol), and denaturing reagents (SDS and urea). The E. coli cell harboring the pUC18-derived agarase expression vector was able to efficiently excrete agarase into the culture medium. Hence, this expression system might be used to express secretory proteins.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제20권10호
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• pp.1378-1385
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• 2010

A novel agarolytic bacterium, KY-YJ-3, producing extracellular agarase, was isolated from the freshwater sediment of the Sincheon River in Daegu, Korea. On the basis of Gram-staining data, morphology, and phylogenetic analysis of the 16S rDNA sequence, the isolate was identified as Cellvibrio sp. By ammonium sulfate precipitation followed by Toyopearl QAE-550C, Toyopearl HW-55F, and MonoQ column chromatographies, the extracellular agarase in the culture fluid could be purified 120.2-fold with a yield of 8.1%. The specific activity of the purified agarase was 84.2 U/mg. The molecular mass of the purified agarase was 70 kDa as determined by dodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The optimal temperature and pH of the purified agarase were $35^{\circ}C$ and pH 7.0, respectively. The purified agarase failed to hydrolyze the other polysaccharide substrates, including carboxymethyl-cellulose, dextran, soluble starch, pectin, and polygalacturonic acid. Kinetic analysis of the agarose hydrolysis catalyzed by the purified agarase using thin-layer chromatography showed that the main products were neoagarobiose, neoagarotetraose, and neoagarohexaose. These results demonstrated that the newly isolated freshwater agarolytic bacterium KY-YJ-3 was a Cellvibrio sp., and could produce an extracellular ${\beta}$-agarase, which hydrolyzed agarose to yield neoagarobiose, neoagarotetraose, and neoagarohexaose as the main products.

• 생명과학회지
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• 제26권4호
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• pp.453-459
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• 2016

경상남도 남해군 미조면 연안으로부터 채취한 해수를 Marine agar 2216 배지에 도말하여 한천분해활성을 보이는 SH-4 균주를 분리하였다. 선택된 SH-4 균주는 16S rDNA 염기서열분석을 통해 Simiduia sp. SH-4로 명명하였다. Simiduia sp. SH-4 균주의 배양액으로부터 한천분해효소를 획득하여 한천분해활성을 측정하였다. 한천분해활성의 강도에 있어서 Simiduia sp. SH-4 유래 한천분해효소의 최고활성은 120.4 U/l로 나타났다. 한천분해활성은 30℃에서 최고치를 나타내었으며, 30℃에서의 활성을 100%로 하였을 때 20℃에서 30%, 40℃에서 75%의 상대활성을 나타내었다. 최적 pH는 pH 6.0으로 pH 6.0의 활성을 100%로 하였을 때 pH 5.0과 pH 7.0에서 각각 91%와 59%의 상대활성을 나타내었다. TLC 분석 결과, Simiduia sp. SH-4는 neoagarotetraose 및 neoagarobiose 등의 neoagarooligosaccharides를 생성하는 것으로 보아 β-agarase를 생산하는 균주로 확인되었다. 따라서 Simiduia sp. SH-4균주와 이 균주가 생산하는 β-agarase는 식품, 화장품, 의약품 산업에서 기능성소재 생산자로서 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

• 생명과학회지
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• 제32권10호
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• pp.778-783
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• 2022

본 연구에서는 해양 한천분해세균인 Simiduia sp. SH-2을 분리하여 생장과 agarase의 특성을 조사하였다. 경상남도 남해군 미조면 연안에서 채취한 해수를 Marine agar 2216 배지에 도말하여 한천분해활성을 보이는 SH-2 균주를 분리하였다. 선택된 SH-2 균주는 16S rDNA 염기서열분석을 통해 Simiduia sp. SH-2로 명명하였다. Simiduia sp. SH-2 균주의 배양액으로부터 한천분해효소를 획득하여 한천분해활성을 측정하였다. Simiduia sp. SH-2 유래 한천분해효소의 최고활성은 625 U/l로 나타났다. 한천분해활성은 40℃에서 최고치를 나타내었으며, 40℃에서의 활성을 100%로 하였을 때 20℃에서 31%, 30℃에서 71%의 상대활성을 나타내었다. 최적 pH는 pH 7.0으로 pH 7.0의 활성을 100%로 하였을 때 pH 6.0과 pH 8.0에서 각각 94%와 89%의 상대활성을 나타내었다. 한천분해효소는 20, 30℃에서 2시간 동안 열처리한 후에도 96%의 잔존활성을 나타내었고, 40℃에서 2시간 동안 열처리한 후에도 49%의 잔존활성을 나타내었다. Simiduia sp. SH-2는 neoagarotetraose 및 neoagarohexaose 등의 neoagarooligosaccharides를 생성하여 β-agarase를 생산하는 균주로 확인되었다. 따라서 Simiduia sp. SH-2 균주와 이 균주의 β-agarase는 식품, 화장품, 의약품 산업에서 기능성 소재의 생산자로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.