Nutritional factors regulating the morphological differentiation and physiological differentiation of Streptomyces exfoliatus SMF13 on surface cultures were evaluated. S. exfoliatus SMF13 produced leupeptin and chymotrypsin-like protease (CTP) at the stage of substrate mycelium growth, and leupeptin-inactivating enzyme (LIE) and trypsin-like protease (TLP) at the stage of aerial mycelium growth. The activity of leupeptin and CTP was high in the region of active growing substrate mycelium, whereas the activity of LIE and TLP was high in the region of aerial mycelium or spores. The differentiations were induced in glucose-limited conditions or by the addition of glucose anti-metabolite (methyl $\alpha$-glucopyranoside), but repressed by high concentrations of glucose or casamino acids. Morphological differentiation (formation of aerial mycelia and spores) was closely related with physiological differentiation (formation of brown-pigment, LIE and TLP). The local distribution of leupeptin, CTP, LIE, and TLP in a developing colony showed that colony development correlated with the production and functions of the compounds: CTP is essential for providing a nitrogen source for mycelium growth: leupeptin regulates TLP activity: LIE inactivates leupeptin: TLP hydrolyzes nongrowing mycelium.
우슬이 민간요법으로 관절염 치료에 우수한 한약재로 알려진 바 우슬 추출물이 cathepsin B 에 대한 저해력을 검토하기 위하여 각종 용매로 우슬 추출물을 순차 분획하고 분획 추출물에 대하여 cathepsin B에 대한 저해활성을 검토하였으며 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone이 추출분획에 검출되는지 TLC 및 HPLC를 이용하여 분석하였으며 우슬의 지표물질이 cathepsin B에 대한 저해활성여부를 확인한바 다음과 같은 결과를 얻었다. 우슬 뿌리에 대해 methanol/water(4:1, v/v) 추출물을 ethyl acetate, chloroform, chloroform/methanol(3:1, v/v), methanol의 각 용매로 분획한 결과, 분획 F4(methanol 분획)에서 수율이 가장 높아 $8.27\%$를 나타내었다. 각 분획별에 따라 cathepsin B에 대한 저해활성을 측정한 결과 F4분획물에서 가장 저해활성이 높았으며 F1분획에서도 높은 저해활성을 나타내었다. F4분획물 중 우슬의 지표물질인 20-hydroxy ecdysone이 검출되었으며 우슬에 함유되어있는 함량은 $0.33\%$이었다. 20-hydroxy ecdysone에 대하여 cathepsin B저해활성을 보기 위하여 cathepsin B저해활성제로 알려진 leupeptin과 활성을 비교해본 결과 기질을 BANA로 사용하였을 경우 leupeptin은 저해율이 $92\%$인데 비하여 20- hydroxy ecdysone은 $88\%$이었으며 F4분획물은 $97\%$를 나타내었고 기질을 CLN으로 사용하였을 경우 leupeptin은 저해율이 $62\%$인데 비하여 20-hydroxy ecdysone은 $36\%$이었으며 F4추출물은 $67\%$를 나타내었다.
이 연구에서는 질편모충의 단백질 분해효소를 부분정제하고 그 특성을 관찰하였다. 질염환 자에서 얻은 질편모충 분리주 KT-9을 sonicator로 분쇄 원심분리하여 상청액을 얻어 bacitracin-sepharose affinity chromatography로 부분정제하였고 합성기질 인 Bz-Pro-Phe-Arg-Nan로 효소의 활성을 측정하였다. 정제한 효소는 pH 7에서 최적 활성을 보였고 Dn를 넣었을 때에는 pH 6 및 pH 9이었다. 최적 온도는 $37^{\circ}C$이었지만 높은 온도에서도 활성이 나타났다. 정제한 효소는 cysteine계열의 저해제인 E-64, antipain, leupeptin에 의해, 그리고 $Hg^{2+},{\;}Zn^{2+}$ 이온에 의해 활성이 저해되었고. DTF와 cysteine에 의해서는 효소의 활성띠 2~3배 증가하였다. 등전점(pl)은 7.2이었고, gelatin SDS-PAGE에서 정제한 효소는 gelatin을 분해하였으나 cysteine계열 저해제인 I-64. iodoacetic acid(IAA), leupeptin, antipain과 반응한 후에는 gelatin을 분해하지 못하였고, PMSF나 EUfA는 영향을 미치지 못했다. 정제한 효소는 SDS-PAGE에서 분자량이 60 kDa이었고 면역이적법에서 면역 혈청과 반응하여 항원성을 나타내었다. 이상의 결과로 보아 60 kDa의 정제한 단백질 분해효소는 항원성을 갖는 cysteine계열 분해효소로 숙주-기생충 상호 관계에서 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
전보에 이어, 정제한 혈합육어 trypsin에 대하여 효소적 성질 및 열 역학적 성질에 관하여 비교 검토한 내용을 요약하면 다음과 같다. 이들 혈합육어 trypsin은 BA-p-NA와 SP-p-NA 같은 amide기질 중 BA-p-NA기질만에 대하여, 그리고 ATEE, BAEE, BTEE 및 TAME 등의 ester 기질 중에서는 BAEE와 TAME에 대하여만 현저한 활성을 보였다. 이들 효소는 antipain, leupeptin, DFP, TLCK, SBTI 등 화학약제와 금속이온 Cu$^{2+}$ 및 Hg$^{2+}$에 의하여서는 그 활성이 현저히 저해를 받았으나, $Mg^{2+}$에 의하여서는 부활하였다. 이 효소들은 모두 5$0^{\circ}C$ 이상의 온도에서는 불안정하였으며, 날개다랭이의 trypsin이 온도 변화에 대하여 가장 안정하였다. 그리고, 활성화에너지는 멸치 trypsin이 13.91㎉/mo1e, 고등어 trypsin A는 11.61㎉/ mole, 고등어 trypsin B는 8.43㎉/mo1e, 황다랭이 trypsin은 4.35㎉/mole, 그리고 날개다랭이 trypsin은 3.76㎉/mole 이었다.
대장균의 세포질내에 존재하는 단백질 분해효소(protease Ci)를 추출하여 그 성질을 조사하였다. 이 효소는 insulin, glucagon 및 bovine growth hormone을 분해시키나, bovine serum albumin, casein 및 globin 등은 분해시키지 않는다. 이 효소의 native 한 상태에서의 분자량은 120,000이며, 54,000 dalton의 동일한 2개의 subunit로 구성되어 있다. Protease Ci의 최적 pH는 7.5이며 등전점은 5.5이다. 이 효소는 o-phenanthroline에 의해 저해되며, $Mn^++나 Co^++$와 같은 metal 이온들에 의하여 활성화되므로 metalloprotease임을 알 수 있다. 이 효소는 p-hydroxymercuribenzoate에 의해서 크게 저해되나 sulfhydryl protease의 specific한 저해제인 Ep475와 leupeptin에 의해서는 영향을 받지 않는다. 대장균 세포내에서는 또 다른 insulin 분해효소 (protease Pi)가 존재하는데, 이 효소는 periplasm에 존재하므로 protease Ci와는 다르다.
Park, Jong-Hwa;Chang, Kyung-Hwa;Lee, Youn-Hyung;Kim, Hae-Yeong;Yang, Jai-Myung;Chung, In-Sik
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제12권4호
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pp.563-568
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2002
Stably transformed Drosophila melanogaster 52 cells producing recombinant VP7 were obtained, and recombinant VP7 expression was confirmed by Western blot analysis. The molecular weight of recombinant VP7 expressed in 52 cells was approximately 35.5 kDa, and 75% of the total VP7 produced was present in the medium. Recombinant VP7 contained N-linked glycosylated oligosaccharides. Aprotinin, leupeptin, and polyvinylpyrrolidone did not have any noticeable effect on recombinant VP7 production; however, DMSO and sodium butyrate increased its production by 120% and 60%, respectively.
A protease, actinidin, was isolated from Cheju kiwi fruit Actinidia chinesis. The enzyme was purified about 8.5 fold with the yield of 25% by column chromatographies of DEAE-Toyopearl and Sphadex. G-100. Purified enzyme gave a single protein band on polyacrylamide gel electrophoresis and its molecular weight estimated by SDS-PAGE was about 27, 000. The optimum pH and temperature were 7.0 and 4$0^{\circ}C$, respectively. This enzyme was stable at the ranges of pH 5.0~9.0 and below 5$0^{\circ}C$. It was also found that Fe+2, Fe+3, and Na+ ions increased enzyme activity, whereas Hg+2 and Co+2 ions decreased. The enzyme was inhibited by phenylmercuric acetate and leupeptin, which indicated that active center of the emzyme had thiol-group. The enzyme reaction followed the Michaelis-Men-ten dkinetics with the Km value of 0.32 mM for casein.
전통 메주로부터 plasmin의 혈전용해 활성보다 약 58% 더 높은 활성을 나타내는 MJ-226을 분리하여 동정한 결과, Bacillus subtilis와 유사한 형태학적, 생화학적 및 당 발효능을 나타내었다. B. subtilis MJ-226은 Tryptic Soy Broth (TSB) 배지 상에서 최대의 혈전용해효소 활성을 나타내었고, $37^{\circ}C$에서 24~26시간 배양했을 때 가장 높은 활성을 나타내었고, TSB 배지 내에 glucose와 fructose 2.0%와 peptone 및 yeast extract 1.0% 각각을 첨가한 경우 활성이 증가되었다. 하지만 lactose, sucrose, beef extract, casein 및 tryptophan 등에 의해선 활성이 오히려 감소되었다. B. subtilis MJ-226이 생산하는 혈전용해효소는 pH 6.0~8.0 및 온도 $35\sim40^{\circ}C$에서 매우 안정하였으며, 또한 $MnSO_4$, $CaCl_2$, KCl 및 NaCl 5 mM 농도의 금속이온에 대해서도 비교적 안정함을 유지하였다. 그러나 $CuSO_4$, $MgSO_4$, $ZnSO_4$, $FeSO_4$와 $BaCl_2$에 등의 금속이온과 iodoacetic acid, leupeptin, phenylmethanesulphonyl fluoride (PMSF), sodium dodecyl sulfate (SDS), thiourea, trans-1,2-diaminocyclohexane-N,N,N',N'- tetraacetic acid (CDTA) 및 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 등의 저해제들과 반응한 경우에는 매우 불안정한 것으로 나타났다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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