• 한국미생물·생명공학회지
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• 제6권1호
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• pp.33-40
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• 1978

Immobilization of alkaline protease was investigated by absorbing the enzyme on adsorbents. Alkaline protease was adsorbed on silica gel selected as a carrier to immobilize the enzyme. In this study, properties of the immobilized enzyme were compared with those of the soluble enzyme. 1) The optimum pH (10.0) of the enzyme was not changed, but the activity was increased at alkaline pH by immobilization. 2) The optimum temperature of the immobilized enzyme was shifted from 50$^{\circ}C$ to 45$^{\circ}C$, while the temperature-activity Profile became broader than those of the soluble enzyme. 3) The pH stability of the immobilized enzyme was significantely increased at pH 4.0, althouth it did not change in the neutral and alkaline pH region. 4) The heat stability of the enzyme was enhanced in the temperature range of 55$^{\circ}C$∼65$^{\circ}C$ by the immobilization. 5) The immobilized enzyme retained 40％ of its original activity after repetitive use for 6 times. 6) The enzyme stability was greately improved for a prolonged storage at 4$^{\circ}C$.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제22권6호
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• pp.818-825
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• 2012

Keratinases are exciting keratin-degrading enzymes; however, there have been relatively few studies on their immobilization. A keratinolytic protease from Chryseobacterium sp. kr6 was purified and its partial sequence determined using mass spectrometry. No significant homology to other microbial peptides in the NCBI database was observed. Certain parameters for immobilization of the purified keratinase on chitosan beads were investigated. The production of the chitosan beads was optimized using factorial design and surface response techniques. The optimum chitosan bead production for protease immobilization was a 20 g/l chitosan solution in acetic acid [1.5% (v/v)], glutaraldehyde ranging from 34 g to 56 g/l, and an activation time between 6 and 10 h. Under these conditions, above 80% of the enzyme was immobilized on the support. The behavior of the keratinase loading on the chitosan beads surface was well described using the Langmuir model. The maximum capacity of the support ($q_m$) and dissociation constant ($K_d$) were estimated as 58.8 U/g and 0.245 U/ml, respectively. The thermal stability of the immobilized enzyme was also improved around 2-fold, when compared with that of the free enzyme, after 30 min at $65^{\circ}C$. In addition, the activity of the immobilized enzyme remained at 63.4% after it was reused five times. Thus, the immobilized enzyme exhibited an improved thermal stability and remained active after several uses.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제21권12호
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• pp.1250-1256
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• 2011

In this study, Bacillus licheniformis cells were immobilized by entrapment in calcium alginate beads and were used for production of alkaline protease by repeated batch process. In order to increase the stability of the beads, the immobilization procedure was optimized by statistical full factorial method, by which three factors including alginate type, calcium chloride concentration, and agitation speed were studied. Optimization of the enzyme production medium, by the Taguchi method, was also studied. The obtained results showed that optimization of the cell immobilization procedure and medium constituents significantly enhanced the production of alkaline protease. In comparison with the free-cell culture in pre-optimized medium, about 7.3-fold higher productivity was resulted after optimization of the overall procedure. Repeated batch mode of operation, using optimized conditions, resulted in continuous production of the alkaline protease for 13 batches in 19 days.

• 생명과학회지
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• 제20권11호
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• pp.1656-1661
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• 2010

난황단백질 가수분해를 위한 알칼리성 단백질분해효소를 5가지 담체 Duolite A568, Celite R640, Dowex-1, Dowex 50W 그리고 Silica gel R60 에 고정화하였다. Duolite A568의 경우에 24.7%의 최대 고정화 효율을 나타내었다. 자유 효소와 고정화 효소에 대한 최적의 pH는 각각 8과 9였고, 최적의 pH는 고정화에 의해 염기성으로 1만큼 증가하였다. 그러나 최적 온도는 자유 효소와 고정화 효소 모두 $50^{\circ}C$로 같았다. 고정화 효소가 자유 효소에 비해 높은 열 안정성을 보였다. 재사용 회분식 공정에서 10 cycle 동안 효소활성은 초기 활성의 86%를 유지하였다. 연속 공정을 위한 충진층 반응기에서 여러 유속에 대한 장기 조업에서 효소 활성의 안정성 평가하였는데 낮은 유속일수록 높은 활성을 유지하였다. 연속 조업에서 casein과 난황 단백질을 사용하여 원료에 대한 고정화 효소의 활성에 대한 영향을 조사하였다. 96시간 연속 조업에서 casein의 경우는 초기 활성의 83%를 유지하였고 난황 단백질의 경우는 초기 활성의 61%를 유지하였다.

• 한국수산과학회지
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• 제30권3호
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• pp.466-472
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• 1997

명태 (Alask pollack, Theragia chalcogramma) 고기풀 수세액 중의 단백질 활용방안으로 기능성 peptide생산을 위해 고정화 protease를 이용한 생물반응기에서 가수분해하여 gel 여과후 정제 peptide의 특성 및 아미노산 존재 여부를 파악하기 위해 실험한 결과는 다음과 같다. 1. $0.5\%$ 농도의 고기를 수세액을 반응온도 $50^{\circ}C$에서 24시간 가수분해 하였을 때 분해율은 $50\%$ (OPA법)였다. 2. Sephadex G-50 column chromatography에 의한 고기풀 수세 액과 조peptide의 분자량은 각각 $10,000\~50,000Da$과, $600\~12,000Da$의 광범위한 분포를 나타내었다. 3. SP-Sephadex C-25 $(H^+)$ column chromatography에서 식염농도 $0\~3\%$의 농도구배에서 $0.6\~0.9\%\;NaCl$, pH 2 범위에서 염기성이 약한 아미노산을 함유하였고, $1.2\~2.0\%$에서는 염기성이 강한 아미노산을 함유하는 peptide가 용출되었다. 4. SP-Sephadex C-25 ($(H^+)$ column chromatography에서 분획한 SP-분획을 Sephadex G-50 colum chromatography에서 peptide의 분자량 측정 결과는 대게 저분자로 분자량 1,000Da에서 3,000Da 범위였고, SP-4>SP-3>SP-2>SP-1의 순으로 분자량 분포를 나타내었다. 5. 정제 peptide의 아미노산 조성은 수세 peptide에서 glycine, arginine이 가장 많이 함유하였으며 그외 glutamic acid, alanine, aspartic aicd 등이였고, SP-분획 peptide는 수세 peptide와 대동소이하였으나 SP-2에서 glycine이 $33\%$로 가장 높았다.

• Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE
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• 제10권6호
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• pp.599-602
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• 2005

Truncated form of UBP1, an ubiquitin-specific protease of Saccharomyces cerevisiae, was overexpressed in Escherichia coli. The hexahistidine residue $(His_6)$ was fused to the N-terminus of truncated UBP1 and the corresponding recombinant protein was purified with high yield by immobilized metal affinity chromatography. The truncated form of UBP1 protein was functional to cleave ubiquitinated human growth hormone as substrate. Effects of pH and temperature were investigated in order to optimize deubiquitinating reactions for the truncated UBP1. Optimum temperature and pH for the cleavage reaction were $40^{\circ}C$ and pH 8.0, respectively.

• 한국식품과학회지
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• 제47권4호
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• pp.438-445
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• 2015

L. plantarum K154 고정화와 C. lacerata 균사체 배양물을 이용한 혼합발효를 통해서 다당류, ${\beta}$-glucan과 같은 생리활성물질과 기능성 GABA 생산을 최적화 하고자 하였다. C. lacerata 균사체의 최적 배양 조건으로 glucose 3%, soybean flour 3%, $MgSO_4$ 0.15%를 혼합하여 배지로 사용하였고, 5 L jar fermentor를 이용하여 $25^{\circ}C$에서 7일간 진탕 배양하였다. 배양물은 균사체 함량 29.7 g/L, 다당류 함량 3.1 g/L, ${\beta}$-glucan 2% (w/w), protease 활성 68.96 unit/mL, ${\alpha}$-amylase 활성 10.37 unit/mL로 매우 높게 나타났다. C. lacerata 균사체 배양물을 이용하여 젖산세균 고정화에 의한 혼합발효물의 생균수를 측정한 결과, 배양 1일 째 비드 내에서 젖산세균의 수는 $3.13{\time}10^9CFU/mL$로 높게 나타났고, 배지에 유리된 젖산세균의 수는 배양기간 동안 $1.48{\time}10^8CFU/mL$로 유지하였다. 알지네이트 1.5%를 사용하여 비드를 제조하였을 때, GABA 함량을 측정한 결과 배양 7일 째 비드 내에서 6.30 mg/mL, 배지에서 9.96 mg/mL로 높게 나타났다. 젖산세균 고정화의 재사용 가능성을 확인하기 위해 고정화 비드를 5회간 재사용하여 $30^{\circ}C$에서 15일간 혼합발효한 결과, GABA 생산이 급격히 증가하여 배양 기간 동안 유지하였다. 결론적으로 C. lacerata 균사체 배양물로부터 고정화된 젖산세균을 이용한 혼합발효는 고농도 GABA를 포함된 기능성 소재를 생산할 수 있었으며, 이는 식품 및 생물 산업의 원료로 활용이 기대된다.

• 한국식품과학회지
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• 제22권7호
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• pp.805-811
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• 1990

대두단백질의 기능성을 개선하기 위하여 고정화된 트립신 및 키모트립신으로 가수분해시킨 후, 이 대두단백 가수물의 기능성을 조사하였다. Ferguson plot으로부터 가수분해물의 평균분자량 및 평균전하를 계산하여 대두단백의 기능성을 나타내는 인자로 이용하였다. 즉, 단백질의 평균분자량을 평균전하로 나눈 값은 단백가수물의 용해도, 포수력, 포유력, 유화도 등의 기능성을 예측하는데 이용될 수 있었다. 이 분자비가 낮으면 용해도는 향상되었으나 포수력은 감소되었으며 중간범위일 경우 포유력과 유화도는 증가되는 경향을 나타냈다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제18권1호
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• pp.56-60
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• 1990

Brevibacterium sp. CH1 균주가 흙으로부터 분리하여 아크릴로니트릴을 아크릴아마이드로 생변화를 수행하는데 필요한 효소를 생산하기 위하여 사용하였다. 여러가지 고정화 방법과 효소 안정성이 조사 되었다. Nitrile hydratase는 free cell에 대하여 pH7에서 최대한 안정성을 보여주었다. EDTA와 phenyl menthl fluoride을 protease inhibitor로 선정하여 inhibitor 농도를 변화시키면서 효소의 저장안정성을 평가하였다. 아크릴아마이드가 안정성 및 물리화학적 강도를 고려 할 때 가장 좋은 carrier였다. 고정화 세포의 저장안정성은 4$^{\circ}C$에서 gel상의 아크릴아마이드 농도가 증가함에 따라 감소하였고, 25% 이상의 아크릴아마이드 농도에서 안정성이 매우 낮았다.

• BMB Reports
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• 제43권5호
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• pp.319-324
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• 2010

Experimental bioinformatics data obtained from an E. coli cell-based eukaryotic protein purification experiment were analyzed in order to identify any bottleneck as well as the factors affecting the target purification. All targets were expressed as His-tagged maltose-binding protein (MBP) fusion constructs and were initially purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC). The targets were subsequently separated from the His-tagged MBP through TEV protease cleavage followed by a second IMAC isolation. Of the 743 total purification trials, 342 yielded more than 3 mg of target proteins for structural studies. The major reason for failure of target purification was poor TEV proteolysis. The overall success rate for target purification decreased linearly as cysteine content or isoelectric point (pI) of the target increased. This pattern of pI versus overall success rate strongly suggests that pI should be incorporated into target scoring criteria with a threshold value.