• 대한바이러스학회지
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• 제27권2호
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• pp.239-255
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• 1997

전염성 췌장괴저바이러스 (Infectious pancreatic necrosis virus) DRT 주의 VP1유전자를 대 장균 발현운반체와 Baculovirus에 삽입하여 대장균과 진핵세로에서 VP1단백질의 발현을 연구하였다. 재조합체 pMal-pol 클론 [7]에서 2.7 Kb 단편인 VP1 유전자를 제한효소 XbaI으로 절단하여 Baculovirus 운반체인 pBacPAK9에 클로닝하여 pBacVP1이라 명명하였다. 이 pBacVP1에 클로닝된 VP1유전자를 제한효소 SacI과 PstI으로 절단하여 대장균 발현 운반체인 pQE-30에 클로닝하여 pQEVP1이라 명명하였다. 또한 VP1 단백질의 C-말단에 6개의 히스티딘 $6{\times}His$이 붙어 있는 단백질을 만들기 위하여, pQEVP1 클론의 His부위를 EcoRI으로 절단하고, 또한 pBacVP1을 EcoRI으로 절단하여 생긴 부위에His-EcoRI DNA 단편을 교체시켜 재클로닝하여 pBacHis-VP1을 만들었다. pBacHis-VP1 DNA와 Bsu36I로 처리된 LacZ-Hyphantria cunea nuclear polyhedrosis virus (LacZ-HcNPV)를 함께 lipofectin을 이용하여 곤충세포 (Spodoptera frugiperda cell)에 동시 감염을 시켜서 재조합 바이러스를 선발하여, VP1-HcNPV-1이라 명명하였다. pQEVP1 클론은 6개의 히스티딘 단편이 부착된 VP1단백질을 Ni-NTA resin 크로마토그래피법으로 정제하여 SDS-PAGE와 Western blot으로 확인하였고, 단백질의 활성과 구조에 영향을 주지 않는 6개의 히스티딘 단편 ($6\;{\times}\;His$)이 부착된 94 kDa의 VP1단백질을 정제할 수 있었다. 또한 재조합 바이러스에 감염된 곤충세포에서 VP1 단백질이 발현된 것을 전기영동과 Western blot으로 검색을 한 결과 95 kDa VP1 단백질이 발현이 되었음을 확인하였다.

• Journal of Plant Biology
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• 제37권3호
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• pp.349-355
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• 1994

Viral RNA was extracted from a purified orchid strain of tobacco mosaic virus (TMV-O) from Cymbidium "Grace Kelly". Polyadenylated viral RNAs were primed with Not I-oligo (dT) primer-adapter. First-strand cDNAs were reversely transcribed by Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase (RNAse H-), and then second-strand cDNAs were synthesized by RNase H and DNA polymerase I. The resulting double-stranded cDNAs were ligated into pSPORT1 vector and transformed into competent E. coli strain JM109 cells. The size of cDNAs within the recombinant plasmids was ranging from 0.9 to 3.9 kb. Among the selected clones, pTMO-0205 and -0210 covered the 3' half and the 5' half of the viral genomic RNA, respectively, which were covering more than 99% of the viral genemo size based on sequencing analysis. Two cDNA fragments which were 3.1 kb BamHI and NotI fragement released from pTMO-0.205 and 3.3 kb SalI and BamHI fragment released from pTMO-0210 were ligated with T4 DNA ligase. The clone was almost entire length, lacking only 31 nucleotides from the 5' terminus based on the sequencing result. This method was shown to be efficiently applicable to other plant viral gnomic RNA for the construction of cDNA.n of cDNA.

• BMB Reports
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• 제56권8호
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• pp.463-468
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• 2023

Screening for genetic defects in the cells should be examined for clinical application. The Pearson syndrome (PS) patient harbored nuclear mutations in the POLG and SSBP1 genes, which could induce systemic large-scale mitochondrial genome (mtDNA) deletion. We investigated iPSCs with mtDNA deletions in PS patient and whether deletion levels could be maintained during differentiation. The iPSC clones derived from skin fibroblasts (9% deletion) and blood mononuclear cells (24% deletion) were measured for mtDNA deletion levels. Of the 13 skin-derived iPSC clones, only 3 were found to be free of mtDNA deletions, whereas all blood-derived iPSC clones were found to be free of deletions. The iPSC clones with (27%) and without mtDNA deletion (0%) were selected and performed in vitro and in vivo differentiation, such as embryonic body (EB) and teratoma formation. After differentiation, the level of deletion was retained or increased in EBs (24%) or teratoma (45%) from deletion iPSC clone, while, the absence of deletions showed in all EBs and teratomas from deletion-free iPSC clones. These results demonstrated that non-deletion in iPSCs was maintained during in vitro and in vivo differentiation, even in the presence of nuclear mutations, suggesting that deletion-free iPSC clones could be candidates for autologous cell therapy in patients.

• 한국동물학회지
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• 제27권2호
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• pp.103-116
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• 1984

유전자 구조 및 유전정보 흐름의 차이로 인하여 고등생물의 유전자를 미생물에 직접 cloning하면 원하는 유전자 산물을 얻지 못하는 경우가 많다. 이것을 극복하기 위해서는 화학적인 방법으로 유전자를 합성하든지, 또는 역제효소를 사용하여 고등생물의 mRNA로부터 유전자를 합성하여 cloning하는 방법을 사용한다. 본 연구에서는 oligo(dT)-cellulose column 방법으로 순수분리한 plasmid pBR322의 Pst I site에 cloning하였다. 우선 AMV reverse transcriptase로 primary cDNA를 합성하고, 알칼리를 처리하여 주형 RNA를 제거했다. 이번에는 이 primary cDNA를 주형으로 Klenow enzyme과 reverse transcriptase를 차례로 처리하여 double stranded DNA를 합성하고, 이 때 5' end 근처에 형성되는 hairpin loop을 Sl nuclease로 제거했다. Terminal deoxynucleotidyl transferase를 사용하여, 합성된 dsDNA에는 poly(dC) track을, Pst I endonuclease를 처리한 plasmid DNA에서는 poly(dG) track을 각각 붙인다음 이들을 서로 annealing시키고 E. coli에 transformation시켜서 크기가 큰 plasmid를 갖는 clone을 cracking 방법으로 일처 선별하였다. 이렇게 선별된 clone을 in 냐셔 hybridization 방법으로 조사하여 globin DNA가 들어간 colony를 이차 선별하고 여러 restriction enzyme으로 잘라보아 globin DNA가 cloning된 것을 확인하였다. 토끼 hemoglobin으로 immunize한 rat (Wistar)에서 뽑은 제일차 혈청과 염소에서 뽑은 제이차 혈청의 antibody를 사용한 radioimmunoassay방법으로, cloning된 globin gene이 대장균내에서 발현되는 지의 여부를 살펴 보았는데, 박테리아의 $\\beta$-lactamase와 토끼의 globin이 결합된 chimeric protein이 대장균 내에서 다량 합성되며, 이 단백질은 토끼 hemoglobin의 antigenic determinant를 가지고 있음을 알 수 있었다.

• 미생물학회지
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• 제32권4호
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• pp.258-263
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• 1994

보리수나무(Elaeagnus umbellata) 뿌리혹엣 분리한 공생균주인 Frankia 균주 EuIK1 게놈에 대해 K. pneumoniae의 nifH,D를 탐침으로 Southern hybridization을 수행한 결과, 3.2 Kb와 5.5 Kb BamHI 절편과 15 Kb PstI 절편이 강한 혼성화 반응을 보여 이들 절편에 nifH,D 유전자가 존재함을 확인하였다. 동일 탐침을 사용한 colony hybridization을 통해 pWE15 cosmid vector 에 작성되 게놈 library로부터 하나의 nif-클론 (pEuNIF)을 선별하였다. 이 클론을 BamHI으로 절단한 후 동일한 탐침으로 혼성화 반응을 수행한 결과, 3.2 Kb와 5.5 Kb가 강한 혼성화 반응을 보였으며, 이 결과는 게놈 혼성화 반응 결과와 일치하였다. 그러나 Frankia FaC1의 nifH 만을 탐침으로 이용한 결과 3.2Kb BamHI 절편만이 혼성화 반응을 나타내었다. 또한 3.2 Kb의 3‘ 말단과 5.5 Kb의 5’ 말단의 염기서열로부터 추론한 아미노산 서열을 ArI3의 nifD와 비교한 결과 182번부터 240번까지, 241번부터 282번까지의 아미노산 서열과 각각 매우 높은 유사성을 보였다. 이러한 결과로부터 3.2Kb 절편에는 nifH와 일부의 nifD 서열이 존재하고, 이 절편에 연속된 5.5Kb 절편에는 나머지 nifD서열이 존재함을 알 수 있었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제19권6호
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• pp.575-582
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• 1991

글루타치온 생산증대를 도모하기 위하여 글루타치온 합성에 관여하는 효소들인 GSH-I 및 GSH-II 유전자들 pBR322 벡터에 클로닝하였다. gshI 유전자를 클로닝하기 위하여 GSH-I 효소활성이 결여된 GS903 균주를 분리하였다. E. coli K-12 염색체 DNA로부터 분리된 3.6Kb PstI DNA 절편을 pBR322 벡터에 클로닝하였다. gshII 유전자는 2.2Kb PstI-BamHI DNA 절편내에 존재하며 이 절편을 pUC13 벡터에 클로닝하였다. 플라스미드의 copy number와 gsh 유전자들을 포함하고 있는 삽입 DNA의 크기의 차이에 의한 gsh 유전자들의 발현 정도를 조사하기 위하여 pGH1090, pGH101, pGH200, pGH201, pLF4, pLF6 그리고 pGH300같은 여러 플라스미드를 사용함으로써 gshI 유전자의 발현이 의해 2배이상 증가하였다. 그러나 벡터 플라스미드내에 존재하는 gsh 유전자들을 포함하는 삽입 DNA의 크기의 차이에 의해서는 gsh 유전자들의 발현이 영향을 받지 않았다.

• 한국동물생명공학회지
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• 제34권3호
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• pp.232-239
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• 2019

In general, cloned pigs have been produced using the somatic cell nuclear transfer (SCNT) technique with various types of somatic cells; however, the SCNT technique has disadvantages not only in its low efficiency but also in the development of abnormal clones. This study aimed to compare early embryonic development and quality of SCNT embryos with those of induced pluripotent stem cells (iPSCs) NT embryos (iPSC-NTs). Ear fibroblast cells were used as donor cells and iPSCs were generated from these cells by lentiviral transduction with human six factors (Oct4, Sox2, c-Myc, Nanog, Klf4 and Lin28). Blastocyst formation rate in iPSC-NT (23/258, 8.9%) was significantly lower than that in SCNT (46/175, 26.3%; p < 0.05). Total cell number in blastocysts was similar between two groups, but blastocysts in iPSC-NT had a lower number of apoptotic cells than in SCNT (2.0 ± 0.6 vs. 9.8 ± 2.9, p < 0.05). Quantitative PCR data showed that apoptosis-related genes (bax, caspase-3, and caspase-9) were highly expressed in SCNT than iPSC-NT (p < 0.05). Although an early development rate was low in iPSC-NT, the quality of cloned embryos from porcine iPSC was higher than that of embryos from somatic cells. Therefore, porcine iPSCs could be used as a preferable cell source to create a clone or transgenic animals by using the NT technique.

• 생명과학회지
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• 제19권11호
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• pp.1529-1537
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• 2009

L-arginine 구조유사체인 L-canavanine의 인체 급성백혈병 Jurkat T 세포에 대한 apoptosis 유도활성이 단백질 티로신키나아제 $p56^{lck}$에 어떻게 조절되는지를 규명하기 위해 $p56^{lck}$를 발현하는 Jurkat T 세포주 E6.1과 $p56^{lck}$-결손 Jurkat T 세포주 JCaM1.6에 있어서 L-canavanine의 세포독성, L-canavanine에 의해 유도되는 apoptotic DNA fragmentation 및 apoptotic sub-$G_1$ peak를 비교하여 본 바, $p56^{lck}$-negative JCaM1.6 세포가 $p56^{lck}$-positive E6.1 세포에 비해 L-canavanine의 apoptotis 유도활성에 훨씬 더 민감한 것으로 나타났다. 이러한 $p56^{lck}$-negative JCaM1.6 세포의 민감성은 JCaM1.6 세포에 $p56^{lck}$ 유전자를 transfection시켜 발현시키면 현저히 감소되었다. L-Canavanine에 의해 유도되는 apoptosis관련 현상들을 $p56^{lck}$-stable transfectant인 JCaM1.6/lck 세포와 empty vector-transfectant 인 $p56^{lck}$-negaive JCaM1.6/vector 세포에서 Western blot analysis로 비교한 결과, L-canavanine에 의해 유도되는 mitochondrial membrane potential (${\Delta\Psi}m$)의 감소, caspase-9, -8, -7 및 -3의 활성화, 그리고 PARP 및 $PLC{\gamma}$-1의 분해가 JCaM1.6/vector 세포에 비해 JCaM1.6/lck 세포에서 더 약하게 나타났다. JCaM1.6/lck 세포를 2.5 mM L-canavanine으로 처리한 다음 세포 내 $p56^{lck}$ kinase 활성의 변화를 $\alpha$-casein을 기질로 하여 시간 별로 측정한 결과, L-canavanine의 처리 후 15분만에 $p56^{lck}$ kinase의 활성이 약 1.6배 증가되었으며 이후 6시간 동안은 약 1.3~1.4 배정도 증가된 수준으로 kinase 활성이 유지되는 것으로 확인되었다. L-Canavanine에 의한 apoptosis의 개시에 Fas/FasL 상호작용이 관련되는지를 규명하기 위해 FADD-negative Jurkat T 세포주 I2.1, caspase-8-negative Jurkat T 세포주 I9.2 및 wild-type Jurkat T 세포주 A3에 대한 L-canavanine의 세포독성을 비교한 결과, A3와 I2.1 세포의 경우는 L-canavanine의 세포독성이 동일하게 나타났고, 특히 caspase-8가 결손된 I9.2 세포의 경우는 L-canavanine의 세포독성에 대한 민감성이 A3와 I2.1 세포에 비해 단지 미약하게만 완화되는 것으로 나타나, L-canavanine의한 apoptosis에는 Fas/FasL 상호작용이 관련되어 있지 않으며, 또한 caspase-8의 역할이 필수적이지 않음을 시사하였다. Jurkat T 세포에 있어서 L-canavanie에 의해 유도되는 sub-$G_1$ peak 및 caspases 활성화에 미치는 pan-caspase inhibitor (z-VAD-fmk), caspase-9 inhibitor (z-LEHD-fmk), caspase-3 inhibitor (z-DEVD-fmk), caspase-4 inhibitor (z-LEVD-fmk) 및 caspase-12 inhibitor (z-ATAD-fmk)의 영향을 조사한 결과, L-canavanie에 의한 apoptosis는 ${\Delta\Psi}m$의 감소, caspase-9 및 caspase -3의 활성화에 뒤따른 caspase-8 및 caspase-7의 활성화, 그리고 PARP의 분해의 순서로 유도되는 것으로 나타났으며, 아울러 caspase-9의 활성화와 함께 caspase-12의 활성화가 L-canavanine 처리에 따른 caspase-3의 활성화에 요구되는 것으로 확인되었다. 결론적으로, L-canavanine 처리에 의한 Jurkat T 세포의 apoptosis는 ${\Delta\Psi}m$ 감소, caspase-9, caspase-3 및 caspase-7의 활성화에 의해 유도되며, 이들 apoptosis 현상들은 $p56^{lck}$에 의해 negative regulation되었다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제16권2호
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• pp.119-130
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• 1989

본 연구는 생식주기중 폐쇄여포액내에서 생물학적， 면역학적 특성을 나타내는 GTH 의 변화를 조사하고 steroid hormone과의 상관관계를 조사하며 국부조절인자로서 의 GTH의 역 활을 조사하고자 하였다. 가임기간중 215개의 여포와 IVF과정에서 185개의 여포를 얻어 여포액내 GTH의 생물학적 또는 면역학적 활성을 측정하였다. Bioactive LH(bLH)는 생쥐의 Leydig cell-testosterone production assay, bFSH는 흰쥐의 Sertoli cell aromatase assay로 측정 하였 다. Immunological GTH(iLH , iFSH) 는 MaiaClone RIA , Delfia kits를 사용하였다. 여포액내 iLH, iFSH , ihCG 는 hyperstimulation에 의해 형성된 여포의 크기와는 무관하였다. 또 hMG, huFSH 의 처리와도 상관성이 없었다. T의 농도가 높은 여포액내의 iFSH는 현저히 낮았으며 E, P 가 고농도인 여포의 ihCG 양은 현저히 낮았다. 과배란이 유도된 난소의 여포액내 iLH는 LH specific RIA로 측정시 3mIU/ml 이하이었다. 생식주기중 여포액내 bLH, bFSH는 배란기에 현저히 증가 하였다. 혈청내 GTH B/I ratio는 엘정한 반면 여포액내 LH，FSH의 생물학적， 면역학적 활성은 미수정란을 가지거나 폐쇄된 여포내의 활성보다 현저하게 높았다. 위의 결과로 보아 여포액내 생식소자극호르온은 면역학적활성보다 높은 생물학적 활성을 가지며， 생리적 현상의 지표가 된다고 추론된다. 또한 steroid, bGTH는 여포의 선택， 폐쇄를 구분하는 지표로 사용가능하며， 여포가 폐쇄될때 여포액내 B/I ratio가 현저히 낮아지는 것으로 보아 GTH의 활성이 감소되는 것으로 판단된다.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제44권4호
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• pp.331-341
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• 2006

Actin binding proteins play key roles in cell structure and movement particularly as regulators of the assembly, stability and localization of actin filaments in the cytoplasm. In the present study, a cDNA clone encoding an actin bundling protein named as AhABP was isolated from Acanthamoeba healyi, a causative agent of granulomatous amebic encephalitis. This clone exhibited high similarity with genes of Physarum polycephalum and Dictyostelium discoideum, which encode actin bundling proteins. Domain search analysis revealed the presence of essential conserved regions, i.e., an active actin binding site and 2 putative calcium binding EF-hands. Transfected amoeba cells demonstrated that AhABP is primarily localized in phagocytic cups, peripheral edges, pseudopods, and in cortical cytoplasm where actins are most abundant. Moreover, AhABP after the deletion of essential regions formed ellipsoidal inclusions within transfected cells. High-speed co-sedimentation assays revealed that AhABP directly interacted with actin in the presence of up to $10{\mu}M$ of calcium. Under the electron microscope, thick parallel bundles were formed by full length AhABP, in contrast to the thin actin bundles formed by constructs with deletion sites. In the light of these results, we conclude that AhABP is a novel actin bundling protein that is importantly associated with actin filaments in the cytoplasm.