네가지 쌀단백군의 양적 관계는 주로 추출조건에 의하여 좌우되며 albumin 및 globulin의 추출양은 교반방법보다 추출온도에 의하여, glutelin은 사용용매의 종류와 pH에 의하여 추출양이 크게 좌우되었다. 적합한 쌀단백질의 추출로는 albumin 및 globulin은 0.5M-NaCl용액으로 $0{\sim}5^{\circ}C$에서, prolamin은 70%(v/v) ethanol용액으로 상온에서, glutelin은 0.1N acetic acid보다는 0.5% SDS-borate buffer (pH 8.3) 과 0.6% ${\beta}-mercaptoethanol$을 포함한 동일용액을 사용하는 것이 효과적이었다. 상기방법으로 추출한 각 단백군 구성성분의 분자량 분포는 albumin은 29,000, $18,000{\sim}15,000$ 및 12,000의 세가지이며 globulin은 27,000, 21,000 17,000 및 12,000의 4가지 이외에 고분자량의 단백질($10^5$이상)로 되어 있고 prolamin은 16,000, 0.5% SDS-borate buffer에 가용성인 glutelin은 35,000, 21,000, 17,000 및 15,000의 4가지와 이외에 globulin의 경우와 같이 고분자 단백질로 구성되어 있었다. Prolamin을 제외한 세 단백군은 각각 disulfide bond로 연결된 subunit를 가지고 있는 구성성분을 포함하고 있음을 알 수 있었다. SDS-glutelin은 Sephadex G-150 column chromatography에 의하여 세가지 fraction으로 분리할 수 있었다. Albumin과 globulin은 starch gel 전기영동상 산성 (pH 3.1)에서는 총 13개 및 21개의 band를 각각 나타내었고 염기성 (pH 8.95)에서는 총 4개 및 6개의 band를 확인할 수 있었다. 쌀품종들은 albumin과 globulin의 starch gel전기영동 pattern에 의하여 구별할 수 있었다. 산성조건에서는 특수 band의 존재 또는 band의 조합양상에 의하여 각 품종의 구별이 가능하였고 염기성조건에서는 각 품종별 구별은 할 수 없었으나 Japonica종을 Indica 또는 Japonica와 Indica교배종과 분리 식별할 수 있었다.
Developing rice endosperm cells display two morphologically distinct rough endoplasmic reticulum (ER) membranes, the cisternae ER (C-ER) and theprotein body ER (PB-ER), the latter delimiting the prolamine protein bodies. We (Li et al., 1993) have recently shown that the storage protein mRNAs are not randomly distributed on these ER types; the C-ER is enriched for glutelin mRNAs, whereas the PB-ER harbors predominantly prolamine transcripts. To address whether these ER types have differnet capacities to translate these mRNAs and translocate their proteins into the lumen, a microsomal fraction enriched in C-ER vesicles was prepared from devleoping rice seeds. When present in an in vitro translatin system, the microsomes were able to proteolytically remove the signal peptide and internalize both preproglutelin and preprolamine within the microsomal vesicles. Of the two species, preprolamine was more effectively translocated and processed. These results suggest that the C-ER has the capacity to recognize and bind both storage protein mRNAs during protein synthesis. Moreover, efficient translocation and processing of glutelin requires additional factors that are deficient or absent in the in vitro system.
내한유채를 $25^{\circ}C$에서 발아시키는동안 질소화합물, 전기영동pattern 및 색도의 변화를 조사하였다. 1, 유채의 단백질은 수용성비단백해 질소가 9.3%, albumin 25.1%, globulin이 24.7%, Prolamine of 2.2%, glutelin이 1.7%였는데 발아에 의하여 수용성비단 백태 질소는 증가하였으나 albumin과 globulin은 감소하였고 prolamine과 glutelin은 발아초기에는 감소하다가 그 이후는 증가하였다. 2. 2%SHMP에 의해 추출되는 유채단백질은 발아시간에 관계없이 53.5$\sim$54.5의 추출율을 나타냈다. 3. 유채단백질을 7.5%polyacrylamide gel로써 전기영동한 결과는 2개의 큰peak와 2개의 작은peak를 보이던 것이 발아30시간에는 각peak의 모양이 둥그스럼해지고, 발아45시간 이후에는 큰Peak 1개만이 둥근 모양으로 나타났다. 4. 유채발아중 단백질추출액의 색도는 400$\sim$700mm의 전파장에서 흡광도가 증가하였으며 특히 500mm에서 현저하였다.
글루텔린은 쌀 종자단백질의 80% 수준에 이르는 산 또는 알칼리에 용해되는 가장 중요한 저장 단백질로, 분자량은 54 kDa 내외이며 22 kDa의 산성사슬과 32kd의 염기성사슬로 구성되어 있다. 지금까지 보고된 13개의 글루텔린 유전자의 염기서열로부터 유추된 단백질 서열의 다중분석에 의하여 계통발생적으로 1군에서 5군까지 5개군으로 나눌 수 있다. 각 군 상호유전자간의 염기서열과 아미노산서열의 유사성은 60%에서 90%에 이르어 이들 각 군은 매우 유사한 아미노산 조성을 보여주고 있다. 그러나 lysine 함량에 있어서는 2.5%에서 3.6%로 약간의 변화를 보여주고 있는데, 이는 argnine이 point mutation에 의하여 lysine으로 변화된 결과임을 알 수 있었다. 각 군에서의 성숙단백질과 염기성 사슬의 등전점은 각각 9.0, 10.0 내외로 매우 유사한 반면, 산성사슬은 각각 6.6, 6.7, 7.2, 8.4, 7.9의 독특한 값을 가지고 있다. 아울러 유전자 암호에서 세번째 염기가 G와 C로 끝나는 암호의 비율(fraction of G+C at synonimous site in codons: GC3s)과 유효 암호수(effective codon number, Nc), 우선 암호수(Preferred codon number)의 분석과 상관그래프는 글루텔린 유전자들의 전이효율의 차이는 거의 없어 유사한 수준으로 발현될 가능성을 제시하고 있다.
네품종의 보리(올보리, 영산보리, 사천 6호, 수원 228호)로 부터 Osborne의 방법과 이것을 변형한 전보의 방법으로 단백질을 분획하여 albumin, globulin, hordein 및 glutelin 획분을 얻어 이들 각획분들을 SDS-PAGE로 분석한 결과 품종간 polypeptide 조성 차이를 관찰할 수 있었으며 특히 hordein과 hordein-I을 pH 3에서 PAGE를 수행 하였을 때 각 품종사이의 pattern에 명확한 차이를 볼 수 있었다. 한편, hordein-I의 아미노산조성은 glutamic acid와 proline 함량이 높았으나 품종간의 아미노산조성차이는 거의 볼 수 없었다.
Ferritin 유전자를 벼의 저장기관인 배유에 특이적으로 발현시킬 수 있는 glutelin, gGlobulin 및 zein 프로모터를 활용하여 쌀알에 최대로 발현시켜, 고부가가치를 가진 가공용 벼 품종을 육성하여 천연의 철 성분이 강화된 유아용 이유식 생산에 이용할 수 있으므로 유아들에게 천연의 철분을 안정적으로 공급할 수 있는 형질전환체를 육성하였다. 종자 저장단백질인 glutelin, globulin 및 zein의 프로모터와 ferritin 유전자를 pMJ21 vector에 pGBF, pGTF 및 pZ4F 등의 Ti-plasmid를 Agrobacterium에 도입하여 동안벼와 화신벼에 형질전환 하였다. 동안벼 종자를 사용하였을 때 pGBF 재조합 유전자는 19.2%, pGTF는 15.0%, pZ4F는 18.4%가 재분화되었고, 화신벼 종자를 사용하였을 때에는 pGBF 재조합 유전자는 6.7%, pGTF는 11.7%, pZ4F는 3.4%가 재분화되었다. 형질전환 벼의 ferritin 유전자의 도입여부는 PCR 분석과 Southern 분석으로 확인하였으며 ferritin 유전자의 유전자 발현은 Norihern 및 Western 분석에 의해 확인하였다. Southern blot 분석 결과로부터 각각의 배유특이 프로모터 유래 형질전환체 중에서 single copy로 도입된 개체를 선발 할 수 있었다. 또한 이들 형질전환 계통들에서 도입유전자의 발현량은 wild type 벼에 비하여 매우 높게 나타났다. 또한 철 단백질의 철분 축적 정도를 분석한 결과 Zein 프로모터를 사용한 형질전환 계통 (T1-2)에서 171.4 ppm으로 wild type과 비교하여 6.4 배의 철분함량 증가를 보였다. 그러나 globulin 및 glutelin 프로모터 유래 형질전환체에서는 wild type과 비교하여 $2.1{\sim}3.0$ 배의 철분함량 증가를 보였다. 벼 형질전환체들의 생육상황을 조사한 결과 초장은 변이 폭이 매우 크게 나타났으며, 대조품종과 비교하여 50%정도 감소한 왜성 및 이형 식물체도 출현되었다. 따라서 본 연구에서는 형질전환체 중에서 표현형 적으로 대조품종과 거의 같은 식물체를 선발하여 후대를 육성하였다. 육성한 T1 세대에서 형질전환체의 초장, 간장, 수장, 분얼수 및 등숙률을 조사한 결과 초장, 간장, 수장, 분얼수에 있어서는 대조 품종과 큰 변이를 보이지 않았으나 등숙률에 있어서는 $53.3{\sim}82.2%$의 비교적 큰 변이를 나타내었다.
년근별(年根別)에 따른 더덕의 일반성분(一般成分), 무기질(無機質) 및 단백질(蛋白質) 성분(成分)을 atomic absorption spectro-photometer, spectrophotometer 및 disc gel electrophoresis에 의한 분석(分析) 결과(結果)는 다음과 같았다. 일반성분(一般成分)은 재배더덕이나 야생더덕에 관계없이 총당(건물중)이 가장 많이 함유된 성분이고 1년근이 68.76%, 5년근이 66.54%로써 재배 년령이 높아짐에 따라 다소 함량이 감소되는 경향이었다. 그 다음 조단백질, 조섬유, 조지방, 회분의 순으로 함유되었고 조섬유를 재외하고는 재배더덕이 야생더덕 보다 그 성분함량이 다소 높았고 재배 년령이 높아짐에 따라 함량이 높아졌으나 조섬유는 별로 증가가 없었다. 무기성분은 K의 함량이 $208.7{\sim}327.9ppm$으로 가장 높았고 Mg, Ca가 그 다음으로 비슷한 함량을 보여 주었고 전반적으로 재배더덕이 야생더덕보다 무기질 함량이 높았으며 Fe를 제외하고는 대체적으로 재배 년근(年根)의 년령이 높아짐에 따라 무기성분 함량이 높아졌다. 그리고 중금속(重金屬)인 Pb와 Cd의 함량은 허용기준량보다 낮게 함유되어 있었다. P는 재배더덕이 야생더덕보다 함량이 3배 정도 높았다. 더덕의 단백질 분획중 가장 많이 함유된 것은 재배와 야생더덕에 상관없이 albumin이 었고 재배년령이 높아질수록 다소 함량이 감소되는 경향이었다. 그 다음 globulin, prolamin 및 glutelin의 순서로 함유되었고 대체로 년근(年根)의 년령이 높아감에 따라 그 함량이 증가되는 경향을 보여주었고 prolamin함량이 $19.74{\sim}22.90%$로 비교적 함량이 높았다. 더덕 단백질의 용해도는 pH 4에서 최소, pH 10에서 최대를 나타냈으며 disc gel 전기영동 패턴은 재배년령이나 재배와 야생더덕에 관계 없이 band의 형태와 수에 별 차이를 인지할 수 없었고 7개의 band로 나타났으며 이들의 주단백질(主蛋白質)의 분자량(分子量)은 약 90,000이었다.
선화녹두(sunhwa-nogdu ; SH)와 재래종 녹두(conventional variety ; C) 2품종의 분리녹두단백(mungbean protein isolate : MPI)을 제조하여, 이들의 아미노산 조성 그리고 용해도에 의한 단백질의 분획 및 분획된 단백질의 전기영동 패턴을 연구하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 즉, MPI의 아미노산조성을 보면 MPI-SH, MPI-C 둘 다 glutamic acid, aspartic acid의 함량이 높게 나타났으며, 함황아미노산의 함량은 낮게 나타났다. 한편 MPI의 아미노산조성은 원시료인 MBF와 거의 유사함을 나타내었고, 두 품종간에도 큰 차이가 없었다. 그리고 MPI를 용해도에 의하여 분별정량 했을 때 $87.6{\sim}92.9%$가 수용성 성분이었으며, prolamin, glutelin, residue는 MPI-C에서 0.25, 1.13, 10.74%로 MPI-SH의 0.25, 0.91, 5.63%에 비해 각각 높게 나타났다. 또한, 전분획의 전기영동 패턴을 살펴본 결과 $6{\sim}10$개의 band를 나타내며 $43,000{\sim}68,000\;dalton$ 범위의 분자량에 집중하는 경향을 나타내었다.
한국산 인삼 단백질의 생화학적 특성을 체계적으로 규명하기 위하여 단백질의 분별정량, SDS polyacrylamide gel 전기영동, pH에 의한 단백질의 용출성 및 아미노산 포성을 분석한 결과는 다음과 같다. 인삼 단백질의 분별정량은 albumin이 66.0%로 가장 많았으며 glutelin이 20.5%이었고 인삼 단백질의 pH에 의한 용출성은 pH3에서 최저를 나타내었으며 $pH6{\sim}8$에서 최고치를 나타내었고 염의 종류 및 그 농도별에 의한 추출성은 sodium염의 경우 차이가 없었다. 수용성 단백질의 침전도는 40%의 ammonium sulfate와 acetone에 의하여 96% 침전하였으며 SDS-poly-acrylamide gel 전기영동의 결과 11개의 band가 확인되었으며 수용성 단백질의 주 단백질의 분자량은 43,000이었다. 수용성 단백질의 아미노산조성은 18종류로써 arginine의 함량이 45.17%로 가장 많았으며 proline 및 cystine의 함량은 매우 낮았다.
재래식 메주의 발효과정에 있어서 단백질 및 아미노산 조성의 변화를 체계적으로 규명하기 위하여 gel-filtration 및 아미노산 자동분석기기로 분석하였다. 재래식 메주의 단백질을 분별정량한 결과 수용성 단백질은 4주때 36.4%, glutelin은 삶은 대두에서 29.6%였으며 발효시간이 경과함에 따라 수용성 단백질은 4주까지 차차 증가하였으나 globulin과 prolamin은 큰 변화가 없었다. Sephadex G-200으로 수용성 단백질이 분획되었으나 4주 때부터 새로운 저분자의 단백질이 분획되었다 발효과정중에 있어서 주단백질의 분자량은 66,000이었다. 재래식 메주의 발효과정에 있어서 아미노산은 17종류로써 glutamic acid가 $87.97{\sim}317.10mM$로써 가장 많았고 그 다음으로 aspartic acid, glycine 순이었다. 단백질분해역가는 시간이 경과함에 따라 차차 증가하는 4주때 가장 높았다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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