• IMMUNE NETWORK
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• 제3권2호
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• pp.96-102
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• 2003

Background: Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) gene-transduced tumor cell vaccines induce very potent systemic anti-tumor immunity in preclinical and clinical models. Our previous phase I clinical trial in patients with metastatic renal cell carcinoma (RCC) has demonstrated both immune cell infiltration at vaccine sites and T cell-mediated delayed-type hypersensitivity (DTH) response to whole tumor cell vaccines. Methods: To investigate the immune responses to autologous genetically- modified tumor cell vaccines, tumor-specific $CD8^+$ T cell lines were generated from peripheral blood lymphocytes (PBL) of a RCC patient 1.24 by repeated in vitro stimulation with either B7.1-transduced autologous RCC tumor cells or B7.1-transduced autologous tumor cells treated with interferon gamma ($IFN{\gamma}$), and cloned by limiting dilution. Results: Among several RCC-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs), a $CD4^+/CD8^+$ double positive T cell clone (17/A2) appeared to recognize $IFN{\gamma}$-treated autologous RCC restricted by HLA-B39. The 17/A2 also recognized other HLA-B39 positive RCC tumor cells after $IFN{\gamma}$ treatment. Conclusion: These results demonstrate that autologous RCC vaccination successfully generates the tumor-specific CTL 17/A2, and suggest that the presentation and recognition of the tumor antigen by the 17/A2 might be upregulated by $IFN{\gamma}$.

• Plant Biotechnology Reports
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• 제3권4호
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• pp.317-324
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• 2009

The insecticidal toxin gene of Bacillus thuringiensis (Bt) is one of the most commonly used in the development of genetically modified (GM) crops. In this research, we analyzed Bt rice showing lepidopteran pest-resistance. The Bt gene is a synthetic Cry1Ac composed of optimal codons for plants, and the Bt protein is targeted to the chloroplast by a transit peptide. Three Cry1Ac rice events (C103-3, C127-1, and C7-1) were analyzed for molecular characterization. C103-3 contains two copies of T-DNA where the left border (LB) region is truncated. Both C7-1 and C127-1 have a single copy of T-DNA, but a part of the vector backbone DNA is inserted into the genome of C127-1; thus, only C7-1 had intact T-DNA. Progenies of C7-1 crossed with the original cultivar, Nakdong, and double-haploid lines from anther culture of lines crossed with the elite cultivar, Dongjin, were analyzed for T-DNA flanking genomic DNA and genotyping. Results showed that an intact T-DNA region without the vector backbone was inserted into the genome and was stably inherited through generations. The C7-1 homozygous event could be used as breeding material to develop GM rice with pest resistance.

• Applied Biological Chemistry
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• 제48권4호
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• pp.335-338
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• 2005

국내에서 개발된 GM 쌀인 밀양 204호, 익산 483호의 정성 PCR 분석법의 개발을 위해 쌀의 내재 유전자로써 SAMDC1(S-adenosylmethionine decarboxylase)에 특이적인 primer (OsSAMDC1-5'/3')쌍을 제작하여 쌀을 포함한 20개 작물에 대해 PCR을 수행하여 쌀에 특이적으로 증폭되는 것을 확인하였다. 또한, 밀양 204호에 삽입된 GUS 유전자와 NOS terminator 연결 부위를 증폭시켜 172 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있는 primer(Os204-5'/OsNOS-3')와 익산 483호에 삽입된 bar 유전자와 NOS terminator 연결 부위를 증폭시켜 161 bp의 PCR 산물을 얻을 수 있는 primer(Os483-5'/OsNOS-3')을 이용하여 국내 개발된 GM 쌀인 밀양 204호, 익산 483호의 PCR 정성 분석법을 확립하였다.

• 대한두경부종양학회지
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• 제19권1호
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• pp.25-33
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• 2003

Background and Objectives: The Herpes Simplex type 2 Defective Infectious Single Cycle virus (DISC virus) is attenuated virus originally produced as viral vaccines but are also efficient gene transfer vehicle. The main goals of this study were to examine the efficiencies of the gene transfer using DISC vectors for various head and neck squamous cell carcinoma cell lines and to evaluate the efficacy of vaccination with DISC virus carrying a immunomodulatory genes (GM-CSF) as cancer therapy in a organotopic oral cavity squamous cell cancer model. Materials and Methods : We determinated the gene transfer efficiency of DISC virus by x-gal stain method and proved gene and protein expression of DISC-GMCSF transfected SCCVII cells by RT-PCR and ELISA method. Also we evaluated the ex vivo vaccination effects of SCCVII/GMCSF (DISC-GMCSF transfected SCCVII vaccine) vaccine on preventing the recurrence of micro-residual tumor. After the vaccination of SCCVII/GMCSF, specific cytotoxic T-cell responses was evaluated by CTL assay. Results: At an MOI of 10 DISC virus showed 64-88% of transfection rates in various head and neck squamous cancer cell lines. SCCVII cells transduced by DISC virus vector (MOI=10) carrying the GM-CSF gene, produced 4.5 nanogram quantities of GM-CSF per $10^6$ cells. In vivo vaccination using tumor cells transduced ex vivo with DISC-GMCSF resulted in better protection rate against subsequent tumor recurrence in organotopic oral cavity cancer model. Although tumor free survival rate was not statistically significantly increased in vaccination group (p=0.078), tumor specific cytotocic T-cell responses were significantly increased in SCCVII/GMCSF vaccination group. Conclusion: These data demonstrate that; 1) The DISC virus vector is capable of efficient gene transfer to various head and neck squamous cancer cell lines, 2) GM-CSF secreting genetically modified tumor vaccine (SCCVII/GMCSF) efficiently protected against tumor recurrence in organotopic micro-residual oral cavity cancer model and produced tumor specific cytotoxic T-cell response. DISC virus-mediated, cytokine gene transfer may prove to be useful as a clinical therapy for head and neck cancers.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제45권3호
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• pp.171-182
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• 2018

파파야는 열대와 아열대 지역에서 광범위하게 재배되고 있는 주요 작물 중의 하나이다. 파파야 열매는 칼로리가 낮고 비타민 A와 C, 미네랄이 풍부하며, 미숙과에는 단백질 분해 효소인 파파인이 풍부하여 의약품, 화장품, 식품 가공 산업 등에 널리 활용되고 있다. 전세계 파파야 산업에서 가장 중요한 제한 요인 중의 하나가 potyvirus에 속하는 papaya ringspot virus (PRSV)에 의해 야기되는 식물병이다. 1992년에 미국 연구자들에 의해 PRSV의 coat protein (cp) 유전자를 발현하는 최초의 PRSV-저항성 GM 파파야 이벤트($R_0$ '55-1')가 만들어졌으며, 1997년에는 이로부터 유래한 GM 품종('SunUp', 'Rainbow')에 대해 미국 정부가 상업적 재배를 승인하였다. 현재까지 GM 파파야 개발은 해충 저항성, 병 저항성(곰팡이, 바이러스), 수확 후 저장성 증대, 알루미늄과 제초제 저항성 등의 형질에 초점을 맞추어 왔다. 아울러 파파야를 동물단백질(백신 등) 생산을 위한 식물공장으로 활용하기 위한 시도도 이루어졌다. 현재, 미국과 중국을 비롯한 약 17개 국가에서 GM 파파야 개발과 포장 실험 또는 상업적 재배가 이루어지고 있다. GM 파파야의 개발과 더불어 생물안전성 평가 및 GM 판별 기술 개발에 관한 연구도 이루어지고 있다. 생물안전성 평가와 관련하여 주로 인체 위해성과 환경 위해성에 관한 분석이 수행되고 있다. 인체 위해성의 경우, 동물 모델을 대상으로 장기간 식이섭취를 통해 일반 및 유전 독성, 알레르기항원성, 면역 반응, GM 유래 단백질의 안정성에 관한 연구가 수행되었다. 환경 위해성의 경우, GM 재배가 토양 미생물 다양성에 미치는 영향, GM 유래 유전물질의 토양 잔류 및 토양 미생물로의 전이 여부에 관한 연구가 이루어졌다. 우리나라, 유럽 및 일본을 비롯한 많은 나라에서는 상업적 재배를 위한 GM 품종 도입이나, 파파야 가공 식품 제조에 비승인 GM 파파야의 사용을 규제하고 있다. 도입 유전자 특이적 또는 이벤트 특이적인 분자표지를 개발하고, PCR(일반, real-time) 또는 loop-mediated isothermal amplification 방법을 통해 GM 여부를 판별하고 있다. 파파야에 대한 초안 수준의 유전체 정보가 2008년에 해독되었으며, 최근에는 차세대 유전체 분석 기술로 확보된 유전체와 전사체 정보를 활용하여 GM 여부를 판별하는 기술도 확립되었다.

• 원예과학기술지
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• 제28권5호
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• pp.836-844
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• 2010

본 연구는 GM 배추와 non-GM 배추 계통간의 식물체 생장 특성, 지방산의 조성 및 무기 영양 성분을 분석하여 GM 작물의 평가를 위한 기초 자료로 이용하고자 실시하였다. GM 배추(SKCP)와 모본(SC) 계통을 중부지역과 북부지역에서 2008년 가을과 2009년 봄과 가을에 밀식 및 일반 배치시험구로 나누어 40일간 재배하고 수확 후 특성을 조사하여 SKCP 계통과 SC 계통간의 차이점 및 재배 지역간의 차이를 분석하였다. 밀식 배치 시험구에서 재배된 배추 식물체의 최외각 엽의 특성 9개 항목에 대하여 조사한 결과, 두 지역에서 재배된 SKCP 계통과 SC 계통간에 통계적 유의차는 두 항목(잎의 모양과 모용수)을 제외하곤 크게 나타나지 않았다. 식물체의 지상부의 특성 6개 항목과 지하부의 특성 3개 항목을 조사한 결과, 두 지역 모두에서 SKCP 계통과 SC 계통간의 통계적 유의차는 거의 나타나지 않았다. 다만, 중륵의 길이가 두 지역에서 계통간 약간의 유의차를 보였으며, 재배 지역간에도 통계적 유의차가 발생하였다. 중부와 북부지역의 일반 배치 시험구의 경우 최외각 잎의 특성을 조사한 결과, 9개의 조사 항목 중 4개의 조사 항목에서 SKCP 계통과 SC 계통간의 통계적 유의차를 보였다. 특히 잎의 길이에서는 계통간, 재배 지역간 그리고 재배 시기별로 변이가 나타나는 것으로 조사되었다. 또한 식물체의 지상부 특성 9개의 조사 항목 중 5개의 항목에서 통계적 유의차가 발생하였으며, 생체중 무게와 중륵의 길이와 넓이에서는 계통간, 지역간 그리고 시기별로 유의차가 크게 나타났다. 2009년도 가을에 중부와 북부 지역의 일반 배치 시험구에서 재배된 배추 식물체의 잎에 존재하는 주된 지방산은 palmitic acid, oleic acid, stearic acid, linoleic acid 및 linolenic acid인 것으로 조사되었다. 5 가지 지방산의 총 함량은 재배 지역 및 식물 계통간에 통계적 유의 차가 없었으나 linolenic acid를 제외한 4가지 지방산은 중부와 북부 지역에서 SKCP 비해 SC 계통이 건중량 1g당 함량이 다소 높은 것으로 조사되었다. 배추 식물체의 잎에 존재하는 무기영양성분의 함량을 조사한 결과, 다량 원소는 질소(N), 인(P), 칼슘(Ca), 칼륨(K), 마그네슘(Mg) 및 나트륨(Na)의 6가지이었고 미량원소는 구리(Cu), 철(Fe), 망간(Mn) 및 아연(Zn)의 4가지로 조사되었다. 무기영양 물질의 대사체 분석 데이터를 표준화 작업하여 스코어를 통해 시각화하여 본 결과, GM 및 non-GM 계통간에 특이적 변이에 따른 클러스터 형성은 확인할 수 없었으나, 지역간 차이에 따른 클러스터 형성은 확인할 수 있었다.

• 원예과학기술지
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• 제32권4호
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• pp.517-524
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• 2014

본 연구는 국내에서 개발된 국화의 GM 이벤트에 대한 실질적 동등성과 환경 위해성 평가를 위해 GM 화훼류 이벤트의 표현형, 생육 및 개화특성 등의 재배적 특성과 병해충의 발달 정도 및 토양미생물의 변화양상 등이 조사되었다. 무측지성 GM 국화의 시험재료로는 무측지성 국화 형질전환체인 LeLS69, LeLS76, LeLS80 등 3계통을 이용하였으며, 대조품종 'Jinba'와 비교 분석하였다. 무측지성 GM 국화의 표현형 검정을 위해 각 계통간 무측지성 발생 정도를 비교하였으며, 재배적 특성 검정을 위해 생육단계별 생육정도 및 개화 특성을 비교하였다. GM 국화의 생리장해 및 병해충 발생 정도를 정식 후 매주 조사하여 변화양상에 대해 분석하였다. 또한 토양 미생물의 변화를 보기 위해 실험 종료시 GM 국화 계통별로 뿌리와 밀접한 부위의 토양을 채취하여 세균, 방선균, 사상균의 발생 정도를 분석하였다. LeLS80은 대조구 'Jinba'에 비해서 무측지성의 발현도가 높은 것을 확인할 수 있었으나, LeLS76과 LeLS69는 무측지성의 발현률이 현저히 낮았다. 'Jinba'와 GM 국화 계통의 생육은 유의성 있는 차이가 보여지지 않았으며, 무측지성의 발현 정도에 따라 각 계통에 대한 유용성이 평가되어야 할 것으로 판단되었다. 특히 LeLS80 계통의 경우는 하계 고온기에 무측지성이 잘 발현됨을 관찰할 수 있어서 향후 무측지성 발현을 위한 유전자원 및 이벤트 개발에 유용할 것으로 추정되었다. 병해충별 발생 정도 분석에서 꽃노랑총채벌레, 점박이응애, 목화진딧물, 온실가루이 등은 발생시기는 종별로 달랐으나 계통간 차이는 보이지 않았었고, 병해충별 총발생량에서도 계통간 유의차는 없는 것으로 나타났다. 토양미생물의 변화를 살펴본 결과, 세균과 방선균은 'Jinba'와 GM 국화 계통간에 유의성 있는 차이가 보여지지 않았으며, 사상균은 모든 GM 국화가 'Jinba'보다 높은 값을 보였다. 종합적으로 볼 때, 지속적인 실질적 동등성 평가를 위해 앞으로 모니터링 연구를 기초하여 다양한 측면에서 접근할 필요성이 있는 것으로 판단되었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제40권1호
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• pp.18-26
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• 2013

살충성 유전자 mcry1Ac1을 포함하고 있는 해충저항성 유전자변형(GM) 벼 Agb0101이 국내에서 개발되었다. 향후 Agb0101 벼의 환경방출에 따른 모니터링과 이력추적을 위해서는 신뢰성 있는 검출방법의 개발이 필요하다. 따라서, 본 연구에서 해충저항성 GM벼의 사후 안전관리를 위한 정성적 및 정량적 PCR 검정 방법을 개발하였다. 벼 녹말분지효소 유전자 RBE4를 PCR 분석의 내재유전자로 사용하였고, 이의 primer쌍 RBEgh-1/-2는 101bp의 PCR 증폭산물을 형성하였다. 정성 PCR 분석을 위해서 삽입된 T-DNA를 바탕으로 특이 primer를 제작하였고, 이벤트 특이적 검출 primer의 경우 Agb0101의 도입유전자 및 벼 염색체 DNA 사이의 5' 또는 3' 인접염기부위를 정확하게 특이적으로 PCR 증폭하였다. 반면, 대조구인 각종 작물, 국내 벼 품종 및 Agb0101과 동일 형질전환 벡터를 갖는 해충저항성 벼에서는 어떠한 PCR 증폭산물도 형성하지 않았다. 표준물질로써 내재유전자 및 이벤트 특이적 단편으로 제조된 pRBECrR을 이용한 real-time PCR 분석에 의해서 정량한계(LOQ)가 10 copies 농도의 범위인 것으로 확인되었고, 이의 유효성을 검증하기 위하여 상이한 농도의 Agb0101시료(10, 5, 3 및 1%)를 real-time PCR 분석하여 정량검정에 대한 표준편차 및 상대표준편차가 각각 0.06 ~ 0.40 및 3.80 ~ 7.01%의 낮은 범위에 포함되는 것을 확인할 수 있었다. 이들 결과로 본 연구에서 개발된 정성 및 정량 PCR 검정 방법이 해충저항성 GM벼 Agb0101의 모니터링 및 이력추적에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 본다.

• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제54권4호
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• pp.296-302
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• 2011

해충저항성 Bacillus thuringiensis (Bt) 벼와 낙동벼의 비표적 생물체인 물벼룩(Daphniamagna)에 대한 급성독성시험을 실시한 결과, 해충저항성 Bt벼의 48시간-$EC_{50}$은 4,429.13 mg/L(95% 신뢰한계는 3908.130~5020.363 mg/L), 무영향 농도(NOEC)는 1,800 mg/L이었고, 낙동벼는 48시간-$EC_{50}$은 2,889.56mg/L (95% 신뢰한계는 1,073.407~6,854.321 mg/L), 무영향농도는 1,000 mg/L이었다. 처리기간 중 해충저항성 Bt벼와 낙동벼간의 급성독성에 영향을 미칠 수 있는 요인은 발생하지 않았다.

• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제52권1호
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• pp.1-7
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• 2009

후대교배종 CM 벼의 정성 PCR 검정방법을 개발하기 위하여, 벼의 내재유전자로써 OsCs-J(rice cytochrome c gene)을 선발하여 OsCytC-5'/3'의 primer쌍을 제작하고, 벼를 포함한 서로 다른 8개 작물에 대하여 PCR을 수행한 결과 벼에 특이적으로 증폭되는 111 bp의 반응 산물을 확인하였다. 국내 개발된 LS28$\times$CryIAc1 GM 벼의 검정 분석으로 정성 PCR 반응을 수행하였다. 정성 PCR을 위하여 GM 벼에 도입된 T-DNA 및 게놈상의 도입유전자 삽입부위의 인접서열을 바탕으로 구조 및 계통 특이적인 검정 primer 쌍을 제작하였다. ActCk-5'/3' primer 쌍을 이용하여 LS28의 T-DNA 내의 actin 프로모터와 OsCK1 유전자 사이를 증폭시켜 306 bp의 PCR 반응 산물을 얻을 수 있었으며, 또한 계통특이 primer 쌍인 CryIAc1 GM 벼유래의 CrLB-5'/3' 및 LS28 GM 벼 유래의 CKRB-5'/3'를 이용한 PCR 반응으로 각각 142 bp와 91 bp의 도입유전자의 인접서열 부위의 특이적인 증폭 산물을 확인할 수 있었다. 계통 특이적 검정을 위한 이들 개발 primer 쌍들은 event 계통과 대조적으로 non-GM 벼와 다양한 작물에 대하여 어떠한 특이적인 PCR 증폭 산물을 형성하지 않았다. 따라서 본 연구에서 계통특이 primer를 이용하여 후대교배종 GM 벼 계통, L528$\times$CryIAc1을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였고, 제시된 방법이 GM 벼의 실용화를 위한 위해성평가의 검정방법 자료로 제공될 수 있음을 확인하였다.