• Natural Product Sciences
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• 제13권2호
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• pp.169-173
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• 2007

Luteolin is a major flavonoid of Lonicera japonica and has anti-inflammatory effect. The activation of proteinase-activated receptor (PAR)-2 and -4 by trypsin appears to play a role in inflammation, In the present study, we examined the inhibitory effects of luteolin on activation of trypsin-induced human leukemic mast cells (HMC-1). HMC-1 cells were stimulated with trypsin, PAR-2 and PAR-4 agonist, in the presence or absence of luteolin. The level of TNF-${\alpha}$ secretion was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The expression of tryptase and phosphorylated-extracellular signal-regulated kinase (ERK) were assessed by Westem blot analysis. Moreover, trypsin activity was measured by the substrate Bz-DL-Arg-p-nitroanilide (BAPNA). TNF-${\alpha}$ secretion and Tryptase expression in trypsin-stimulated HMC-1 cells were markedly inhibited by pretreatment of luteolin. Furthermore, the pretreatment of luteolin resulted in the reduction of ERK phosphorylation and trypsin activity. These results suggest that luteolin might has the inhibitory effects on the PAR-2 and -4-dependent inflammation.

• 한국식품영양과학회지
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• 제39권1호
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• pp.47-53
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• 2010

제주 전통된장으로부터 세포외효소(protease, fibrinolytic enzyme, amylase, cellulase, lipase) 분비능이 우수한 세균을 분리한 후 16S rRNA 유전자 분석과 생리적 특성을 분석하여 균주를 확인하고자 하였다. Protease 분비능은 JR14, JR19, JR25, JR32, JR38, JR47과 JR64가 표준균주인 Bacillus subtilis KCCM12027보다 활성이 높았다. Amylase 분비능은 JR6, JR25, JR38, JR56, JR81에서 나타난 반면 표준균주인 KCCM12027에서는 나타나지 않았다. Cellulase 분비능은 JR6, JR14, JR48과 JR65가 다른 분리균주 또는 표준균주보다 높았으며, lipase 분비능은 JR14와 JR48이 높았다. 혈전용해 활성은 positive control인 plasmin의 용해 영역에 비하여 JR19가 192%로 가장 높았고, hemolysis 활성도 높았다. 혈전용해능이 있는 균주인 JR19, JR32, JR47, JR64의 배양액을 zymography한 결과, 25～75 kDa 사이에서 4～5개의 밴드가 확인되었다. 된장으로부터 분리한 균주들의 16s rRNA 유전자 염기서열을 분석한 결과 모두 Bacillus species와 99%의 상동성을 나타내었으며, 혈전용해능이 가장 우수한 JR19는 B. stratosphericus $41KF2a^T$와 거의 일치하였다.

• 한국축산식품학회지
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• 제33권6호
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• pp.772-780
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• 2013

지방분해효소 활성이 가장 높은 균은 가을철에 집유한 B 지역의 원유로부터 분리한 Acinetobacter genomospecies 10(match %: 99.90)이었으며, 단백질분해효소 활성이 가장 높은 균은 봄철에 B 지역의 원유로부터 분리한 Serratia liquefaciens(match %: 99.39)였다. Acinetobacter genomospecies 10(match %:99.90)는 전형적인 생장곡선의 형태인 시그모이드 곡선의 형태를 나타냈으며, 배양시간별 조효소 활성은 배양시간이 증가할수록 지방분해효소 활성이 증가하다가 정지기 후반부에서부터 사멸기에 도달하기까지는 배양시간이 길수록 활성이 감소하였다. pH에 따른 지방분해효소 활성은 pH 8.5에서 가장 높았고 온도는 $45^{\circ}C$에서 가장 높은 활성을 나타내었다. Serratia liquefaciens(match %: 99.39)의 생장곡선은 전형적인 시그모이드 형태를 나타내었고, 단백질분해효소 활성은 배양 12시간 후에 가장 높았고, 18시간 후에는 다시 감소하는 양상을 나타냈다. 단백질 분해효소의 pH 영향은 2.5에서 활성이 가장 낮았고 pH 8.5에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 또한 반응온도에 의한 효소활성은 $35^{\circ}C$에서 가장 높았다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2001년도 추계학술발표대회
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• pp.906-909
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• 2001

곤충병원성 선충으로부터 각각 공생박테리아를 분리하여 flask 상에서 7일간 배양하여 공생박테리아의 성장정도, 단백질 분해 효소의 생성, 배양상등액의 꿀벌부채명나방 유충에 대한 살충성 및 지방산 함량에 관한 연구를 수행한 결과 XR-PC 및 XR-MK의 성장 및 살충성이 가장 우수한 것으로 나타났으며 protease 활성은 XR-DR이 배양 4일째 최대 활성을 보였으며, 지방산 함량의 경우 XR-PC 및 XR-HY가 다른 종의 지방산 함량에 비해 12:0, 14:0, 13:0 iso, 16:1 cis 5, 17:0 cyclo에서 함량의 차이를 나타내었다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2001년도 추계학술발표대회
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• pp.89-92
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• 2001

Aspergillus niger has been used as a host system to express many heterologous proteins. It has various advantages over other expression systems in that it is a small eukaryotic GRAS (Generally Recognized aS Safe) organism with a capacity of secreting large amount of foreign proteins. However, it has been known that the presence of an abundant protease is a limiting factor to express a heterologous protein. The proteases deficient mutants of A. niger were obtained using UV -mutagenesis. A total of 1 ${\times}$ $10^5$ spores were irradiated with 10-20% survival dose of UV, 600J/M2 at 280nm, and the resulting spores were screened on the casein -gelatin plates. Ten putative protease deficient mutants were further analyzed on the starch plates to differentiate the pro from the secretory mutant. An endogenous extracellular enzyme, glucose oxidase, was also examined to confirm that the mutant phenotype was due to the proteases deficiency rather than the mutation in the secretory pathway. The reduced proteolytic activity was measured using SDS-fibrin zymography gel, casein degradation assay, and bio-activity of a supplemented hGM -CSF (human Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor). Comparing with the wild type strain, less than 30 % of proteolytic activity was observed in the culture filtrate of the protease deficient mutant (pro -20) without any notable changes in cell growth and secretion.

• BMB Reports
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• 제37권3호
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• pp.298-303
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• 2004

In general, a SYPRO Ruby dye is well known as a sensitive fluorescence-based method for detecting proteins by one-or two-dimensional SDS-PAGE (1-DE or 2-DE). Based on the SYPRO Ruby dye system, the combined two-dimensional fibrin zymography (2-D FZ) with SYPRO Ruby staining was newly developed to identify the Bacillus sp. proteases. Namely, complex protein mixtures from Bacillus sp. DJ-4, which were screened from Doen-Jang (Korean traditional fermented food), showed activity on the zymogram gel. The gel spots on the SYPRO Ruby gel, which corresponded to the active spots showing on the 2-D FZ gel, were analyzed by a matrix-assisted laser desorption ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometric analysis. Five intracellular fibrinolytic enzymes of Bacillus sp. DJ-4 were detected through 2-D FZ. The gel spots on the SYPRO Ruby dye stained 2-D gel corresponding to 2-D FZ were then analyzed by MALID TOF MS. Three of the five gel spots proved to be quite similar to the ATP-dependent protease, extracellular neutral metalloprotease, and protease of Bacillus subtilis. Also, the extracellular proteases of Bacillus sp. DJ-4 employing this combined system were identified on three gels (e.g., casein, fibrin, and gelatin) and the proteolytic maps were established. This combined system of 2-D zymography and SYPRO Ruby dye should be useful for searching the specific protease from complex protein mixtures of many other sources (e.g., yeast and cancer cell lines).

• IMMUNE NETWORK
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• 제5권4호
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• pp.193-198
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• 2005

Background: Protease-activated receptor 2 (PAR2) belongs to a family of G protein coupled receptors activated by proteolytic cleavage. Trypsin-like serine proteases interact with PAR2 expressed by a variety of tissues and immune cells. The aim of our study was to investigate whether PAR2 stimulation can lead to the activation of human mac rophages. Methods: PAR2-mediated proliferation of human macrophage cell line THP-1 was measured with MTT assay. We also examined the extracellular regulated kinase (ERK) phosphorylation and cytokine production induced by trypsin and PAR2-agonist using western blot and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), respectively. Results: Treatment of trypsin or PAR2-activating peptide increased cell proliferation in a dose-dependent manner, and induced the activation of ERK1/2 in THP-1 cells. In addition, trypsin-induced cell proliferation was inhibited by pretreatment of an ERK inhibitor (pD98059) or trypsin inhibitor (SBTI). Moreover, PAR2 activation by trypsin increased the secretion of TNF-${\alpha}$ in THP-1 cells. Conclusion: There results suggest that P AR2 activation by trypsin-like serine proteases can induce cell proliferation through the activation of ERK in human macrophage and that PAR2 may playa crucial role in the cell proliferation and cytokine secretion induced by trypsin-like serine proteases.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제13권4호
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• pp.321-327
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• 1985

색소를 형성하지 못하는 Serratia sp. LW-1 균주의 균체의 protease생성조건을 검토하고 효소를 간단한 방법으로 정제하였다. 효소 생산을 위한 최적온도는 brain heart infusion배지에서 $25^{\circ}C$이었으며, 배양후 76-80시간에 최고의 균체의 효소활성을 나타냈다. Aeration효과는 5$\ell$용 flask에 배지량을 1$\ell$주입하여 180 cycles/min으로 진탕배양 하였을 때가 aeration하지 않았을 경우보다 약 8배의 균체의 효소생산을 보였다. 효소의 정 제는 ammonium sulfate침 전, ammonium sulfate분별염석 및 두번의 DEAE-cellulose column 크로마토그라피에 의하여 수행하였으며, 정제된 효소는 정제도가 약 100배, 회수율이 16%이었다. 정제된 효소는 analytical ultracentrifuge pattern에서 단일 단백질로 나타났으며 최고 활성을 나타내는 pH는 vitamin free casein을 substrate로 사용하였을 때 pH 8.5-9.5이었고 최적온도는 4$0^{\circ}C$ 근처이었다

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제16권10호
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• pp.1537-1543
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• 2006

A bacterial strain named HY-3 that produces a highly active extracellular protease was isolated from the digestive tract of a spider, Nephila clavata. The bacterium was a Gram-negative, oxidase-negative, catalase-positive, nonhalophilic, nitrate-reducing, facultative anaerobe. Transmission and scanning electron microscopies demonstrated that the isolate was non-spare-forming, straight, rod-shaped, and motile by peritrichous flagella. The G+C content of the DNA was 57.0 mol%. The isoprenoid quinone type was ubiquinone with 8 isoprene units (Q-8). The morphological and biochemical characteristics including the predominant fatty acid and phospholipids profiles placed the isolate HY-3 in the family Enterobacteriaceae. Further biochemical characterization and phylogenetic studies including determination of an almost complete 16S ribosomal DNA sequence suggested that the bacterium was closely related to the genus Serratia. DNA-DNA hybridization analysis revealed that this extracellular protease-producing strain belongs to Serratia proteamaculans, which is also known far its association with insects.

• 미생물학회지
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• 제46권1호
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• pp.73-79
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• 2010

극지연구소(KOPRI)는 국내외적으로 유일하게 남북극 지역에서 분리한 저온적응성 박테리아 균주를 대상으로 culture collection(약 6,300균주)을 구축하여 운영하고 있다. 보유 중인 프로테아제(protease) 생산 균주들(총 874균주) 중에서 활성이 높은 프로테아제를 생산하는 78개의 균주들을 1차 선발한 후, 1% skim milk가 포함된 0.1${\times}$ ZoBell 고체배지에 접종하고 다양한 온도($5-30^{\circ}C$)에서 배양하면서 세포외분비성 프로테아제의 활성을 비교하였다. 위의 신속하고 직접적인 균주 스크리닝 방법을 통해서, 최종적으로 저온활성 프로테아제를 생산하는 15개의 저온적응성 균주들을 선발하였다. 최종 선발된 균주들은 16S rRNA 유전자의 분석결과 Pseudoalteromonas (13균주)와 Flavobacterium (2균주) 속(genus)으로 분류되었고, $5-15^{\circ}C$ 저온에서도 활성을 나타내는 저온성 프로테아제를 생산하였다. 15개 균주들이 생산하는 각각의 프로테아제는 특이적 화합물에 의한 효소활성 억제 정도에 따라 5개의 그룹(serine protease, aspartic protease, cysteine protease, metalloprotease, 그리고 미분류 프로테아제)으로 분류되었다. 본 실험을 통해서 선발한 남북극 유래 박테리아 균주들은 새로운 저온활성 프로테아제를 발굴하기 위한 유용한 생물자원으로서의 가치를 가지고 있다.