• 한국잡초학회지
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• 제15권3호
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• pp.206-213
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• 1995

Glyphosate를 토마토의 동화산물 공급부위에 처리하였을 때, 제초제결합 단백질인 QB 단백질을 Escherichia coli 내에서 ${\alpha}$-galactosidase가 발현되기 위해 lac Z 유전자의 3' 말단에 cloning된 시금치 psb A 유전자에 의해 발현되는 hybrid 단백질에 대한 항체를 형성시킨 후 이것을 이용하여 immunoblotting을 실시하였다. G1yphosate는 thylakoid 막의 Photosystem II내에 있는 D1 단백질의 붕괴에 영향을 주었다. LHC II 복합체내의 D1 단백질의 기능 이상은 glyphosate 의 다면발현적 효과였다.

• KSBB Journal
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• 제19권6호
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• pp.462-466
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• 2004

S. coelicolor A3(2)로부터 항산화 저분자 thiol분자인 MSH를 HPLC 및 monobromobimane 형광 검출 방법으로 분리${\cdot}$정제하여 그 존재를 확인하였다. 표준물질인 MSH-bimane과 동일하게 용출되는 MSH 분획을 확인하였으며 여러 thiol 분획 중 MSH 분획이 가장 많은 것으로 보아 MSH가 S. coelicolor의 주된 thiol 화합물로 판단되었다. MSH 생합성에 관여하는 효소 중 I-1-Pase의 유전자의 기능을 알아보기 위하여 이 유전자를 방선균에서 분리한 후 대장균에 클로닝하여 과도발현시켰다. 발현된 I-1-Pase를 Ni-NTA column을 사용하여 정제하였다. 정제된 I-1-Pase는 soluble protein으로 281개 아미노산으로 구성되어 있으며 분자량은 32 kDa이었다. 인간 및 대장균의 I-1-Pase와 각각 24와 $25\%$의 sequence homology를 보였으며, 기존의 I-1-Pase가 가지고 있는 공통의 I-1-Pase motif A와 motif B를 S. coelicolor A3(2)도 가지고 있는 것으로 확인되었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제31권4호
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• pp.529-539
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• 2021

The beet armyworm, Spodoptera exigua, is a serious insect pest infesting various vegetable crops. Two infectious insect viruses, baculovirus and iflavirus, are known to induce epizootics in S. exigua populations. Indeed, some laboratory colonies have appeared to be covertly infected by these viruses. Diagnostic PCR tests detected two different viruses: Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrosis virus (SeMNPV) and iflaviruses (SeIfV1 and SeIfV2). Viral extract from dead larvae of S. exigua could infect Sf9 cells and produce occlusion bodies (OBs). Feeding OBs to asymptomatic larvae of S. exigua caused significant viral disease. Interestingly, both SeIfV1 and SeIfV2 increased their titers at late larval stages. Sterilization of laid eggs with 1% sodium hypochloride significantly reduced SeMNPV titers and increased larval survival rate. Double-stranded RNA (dsRNA) specific to SeIfV1 or SeIfV2 significantly reduced viral titers and increased larval survival rate. To continuously feed dsRNA, a recombinant Escherichia coli HT115 expressing SeIfV1-dsRNA was constructed with an L4440 expression vector. Adding this recombinant E. coli to the artificial diet significantly reduced the SeIfV1 titer and increased larval survival. These results indicate that laboratory colony collapse of S. exigua is induced by multiple viral infections. In addition, either suppression of SeMNPV or SeIfV infection significantly increased larval survival, suggesting a cooperative pathogenicity between baculovirus and iflavirus against S. exigua.

• 생명과학회지
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• 제22권11호
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• pp.1545-1551
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• 2012

이전 연구에서 저자들이 Glycoside hydrolase family 50 (GH-50)과 GH-118 ${\beta}$-agarase들의 발현과 특성을 보고한 Agarivorans sp. JA-1 균주로부터 신규의 GH-16 ${\beta}$-agarase를 보고하고자 한다. 본 유전자는 1,362 염기쌍으로 구성되어 있으며, 453 아미노산 잔기로 구성된 49,830 Da의 단백질을 암호화한다. 본 효소는 Pseudoalteromonas sp. CY24 유래의 GH-16 ${\beta}$-agarase와 98%의 염기서열 상동성과 99%의 아미노산서열 상동성을 나타냈다. 신호서열을 제외한 429 아미노산으로 구성된 성숙단백질에 해당하는 유전자를 E. coli BL21 (DE3) 세포에서 재조합 발현시킨 후, 친화성 크로마토그래피로 효소를 정제하였다. 정제된 효소는 $40^{\circ}C$와 pH 5.0에서 67.6 U/mg의 최적 활성을 보였다. 아가로스를 기질로 한 효소분해산물의 박막크로마토그래피 분석결과, neoagarohexaose와 neoagarotetraose가 주산물로 생산되는 것을 알 수 있었다. 본 효소는 기능성 한천올리고당의 산업적 생산에 활용 가능할 것으로 기대된다.

• 미생물학회지
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• 제47권3호
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• pp.200-208
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• 2011

임상에서 가장 문제가 되는 MLS (macrolide-lincosamidestreptogramin B) 항생제 내성은 Erm 단백질에 의하여 23S rRNA의 A2058에 dimethylation시킴으로써 MLS 항생제의 부착능을 저해함으로써 나타내는 내성이다. ErmSF는 다른 Erm 단백질과 달리 매우 긴 N-terminal end region (NTER)을 가지고 있으며 RNA에 잘 부착되는 것으로 알려진 arginine이 25%를 차지하고 있다. 특히 NTER의 점차적인 제거는 이에 따른 점차적인 활성의 감소 그리고 이의 완전한 제거는 98%의 활성소실을 가져다 주는 것으로 밝혀져서 단순 부착에 의한 활성에의 기여를 암시하고 있다. 뿐만 아니라 NTER 다음에 붙어 있는 아미노산은 제거되었을 때 활성이 소실되는 매우 중요한 아미노산임이 밝혀졌다. 이러한 사실에 근거, 서로 다른 복제원점을 가짐으로써 동일한 세포 내에 존재할 수 있으며 발현 체계가 동일하나 copy수가 차이가 있어서 단백질 발현 양에 차이를 가져다 주는 새로운 단백질 동시 발현체계를 개발하고 이를 적용하여 NTER 함유 펩타이드를 copy수가 많은 pET23b 체계의 담체에서, ErmSF는 copy수가 적은 pACYC184 담체 체계에서 발현 시킴으로써 펩타이드가 한 세포 내에서 ErmSF 보다 훨씬 더 많이 발현되도록 하여 이 펩타이드가 ErmSF의 활성을 저해할 수 있는지 확인하였다. 계획된 대로 IPTG에 의한 유도 없이도 펩타이드가 ErmSF보다 세포 내에서 훨씬 많이 발현되었다. 그러나 생체 내에서는 그 활성의 저해를 확인 할 수 없었다. 따라서 ErmSF의 활성은 NTER 펩타이드의 단순한 부착에 의해서 이루어지는 것이 아니라 conformational change 등의 역동적인 상호작용을 통하여 이루어지는 것으로 사료되었다. 따라서 ErmSF와 23S rRNA와의 복합체 구조의 규명 그리고 NTER과 ErmSF protein body의 부착양식에 대한 구체적인 생화학적 규명이 이루어지면 이러한 접근법은 이 단백질의 억제제를 창출하는데 기여를 할 수 있을 것으로 사료된다.

• 미생물학회지
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• 제37권4호
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• pp.245-252
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• 2001

MLS (macrolide-lincosamide-streptogramin B) 항생제 내성인자 단백질인 Erm 단백질들은 아미노산 서열 중 그 동일성과 유사성이 높아 구조적으로도 동등한 단백질의 한 집단을 형성한다. 최근 X-ray crystallography에 의해 구조가 결정된 ErmC\` 및 ErmAM 단백질의 구조에 근거하여 ErmSF 단백질도 catalytic domain과 substrate binding domain으로 구분하였고 N-terminal end에 존재하는 catalytic domain의 대량생산을 다양한 pET 발현 vector를 사용하여 시도하였다. 그리고 catalytic domain을 coding하는 DNA 절편은 세 종류를 사용하였다: DNA 절편 1은 Met 1부터 Glu 186까지를 coding하고 DNA 절편 2는 Arg 60부터 Glu 186까지의 정보를 가진 DNA이고 DNA 절편 3은 Arg 60부터 Arg 240까지를 encoding하는 DNA이다. 사용된 다양한 발현 vector중에서 pET19b는 DNA 절편 3, pET23b는 DNA 절편 1과 2를 성공적으로 대량생산하였다. 그러나 대량생산된 catalytic domain들은 불용성 단백질 집합체인 inclusion body를 형성하였다. ErmSF catalytic domain들의 용해성 단백질의 생산을 위하여 chaperone GroESL과 Thioredoxin의 동시 발현 및 배양온도를 $22^{\circ}C$로 낮추어 시도했으나 대량 발현된 단백질의 용해에는 도움을 얻지 못하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제16권10호
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• pp.1583-1590
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• 2006

T4 endonuclease V (T4 endo V) [EC 3. 1. 25. 1], found in bacteriophage T4, is responsible for excision repair of damaged DNA. The enzyme possesses two activities: a cyclobutane pyrimidine dimer DNA glycosylase (CPD glycosylase) and an apyrimidic/apurinic endonuclease (AP lyase). T4 denV (414 bp cDNA) encoding T4 en do V (138 amino acid) was synthesized and expressed using either an expression vector, pTriEx-4, in E. coli or a baculovirus AcNPV vector, pBacPAK8, in insect cells. The recombinant His-Tag/T4 endo V (rHis-Tag/T4 endo V) protein expressed from bacteria was purified using one-step affinity chromatography with a HiTrap Chelating HP column and used to make rabbit anti-His-Tag/T4 endo V polyclonal antibody for detection of recombinant T4 endo V (rT4 endo V) expressed in insect cells. In the meantime, the recombinant baculovirus was obtained by cotransfection of BacPAK6 viral DNA and pBP/T4 endo V in Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells, and used to infect Sf21 cells to overexpress T4 endo V protein. The level of rT4 endo V protein expressed in Sf21 cells was optimized by varying the virus titers and time course of infection. The optimal expression condition was set as follows; infection of the cells at a MOI of 10 and harvest at 96 h post-infection. Under these conditions, we estimated the amount of rT4 endo V produced in the baculovirus expression vector system to be 125 mg/l. The rT4 endo V was purified to homogeneity by a rapid procedure, consisting of ion-exchange, affinity, and reversed phase chromatographies, based on FPLC. The rT4 endo V positively reacted to an antiserum made against rHis-Tag/T4 endo V and showed a residual nicking activity against CPD-containing DNA caused by UV. This is the first report to have T4 endo V expressed in an insect system to exclude the toxic effect of a bacterial expression system, retaining enzymatic activity.

• International Journal of Oral Biology
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• 제36권3호
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• pp.109-116
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• 2011

Periodontitis results from the activation of host immune and inflammatory defense responses to subgingival plaque bacteria, most of which are gram-negative rods with lipopoly-saccharides (LPSs) in their cell walls. LPSs have been known to induce proinflammatory responses and recently it was reported also that they induce the expression of microRNAs (miRNAs) in host cells. In our current study therefore, we aimed to examine and compare the miRNA expression patterns induced by the LPSs of major periodontopathogens in the human gingival epithelial cell line, Ca9-22. The cells were treated with 1 ${\mu}g$/ml of E. coli (Ec) LPS or 5 ${\mu}g$/ml of an LPS preparations from four periodontopathogens Porphyromonas gingivalis (Pg), Prevotella intermedia (Pi), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa), and Fusobacterium nucleatum (Fn) for 24 h. After small RNA extraction from the treated cells, miRNA microarray analysis was carried out and characteristic expression profiles were observed. Fn LPS most actively induced miRNAs related to inflammation, followed by Aa LPS, Pi LPS, and Ec LPS. In contrast, Pg LPS only weakly activated miRNAs related to inflammation. Among the miRNAs induced by each LPS, miR-875-3p, miR-449b, and miR-520d-3p were found to be commonly up-regulated by all five LPS preparations, although at different levels. When we further compared the miRNA expression patterns induced by each LPS, Ec LPS and Pi LPS were the most similar although Fn LPS and Aa LPS also induced a similar miRNA expression pattern. In contrast, the miRNA profile induced by Pg LPS was quite distinctive compared with the other bacteria. In conclusion, miR-875-3p, miR-449b, and miR-520d-3p miRNAs are potential targets for the diagnosis and treatment of periodontal inflammation induced by subgingival plaque biofilms. Furthermore, the observations in our current study provide new insights into the inflammatory miRNA response to periodontitis.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제21권4호
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• pp.374-378
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• 2011

To find alternative genetic resources for D-serine dehydratase (E.C. 4.3.1.18, dsdA) mediating the deamination of D-serine into pyruvate, metagenomic libraries were screened. The chromosomal dsdA gene of a wild-type Escherichia coli W3110 strain was disrupted by inserting the tetracycline resistance gene (tet), using double-crossover, for use as a screening host. The W3110 dsdA::tet strain was not able to grow in a medium containing D-serine as a sole carbon source, whereas wild-type W3110 and the complement W3110 dsdA::tet strain containing a dsdA-expression plasmid were able to grow. After introducing metagenome libraries into the screening host, a strain containing a 40-kb DNA fragment obtained from the metagenomic souce derived from a compost was selected based on its capability to grow on the agar plate containing D-serine as a sole carbon source. For identification of the genetic resource responsible for the D-serine degrading capability, transposon-${\mu}$ was randomly inserted into the 40-kb metagenome. Two strains that had lost their D-serine degrading ability were negatively selected, and the two 6-kb contigs responsible for the D-serine degrading capability were sequenced and deposited (GenBank code: HQ829474.1 and HQ829475.1). Therefore, new alternative genetic resources for D-serine dehydratase was found from the metagenomic resource, and the corresponding ORFs are discussed.

• 한국가축번식학회지
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• 제27권3호
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• pp.259-268
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• 2003

모유에 존재하는 유지방구의 막을 구성하는 주된 당단백질인 하나인 lactadherin(과거에는 BA46로 일컬어짐)은 rotavirus에 의한 감염증상을 예방하는 것으로 보고되고 있다. 본 연구에서는 retrovirus vector system을 이용하여 Chinese Hamster Ovary (CHO) 세포에 tetracycline에 의해 발현이 제어되는 promoter 하의 lactadherin 유전자를 전이 시킨 후 lactadherin이 tetracycline에 의해 발현이 유도되는지의 여부를 실험하였다. 먼저 기초 실험으로 대장균의 LacZ 유전자를 이용하여 tetracycline에 의한 유도 여부를 시험하였다. RevTet-On과 RevTRE-LacZ retrovirus를 동시감염시킨 NIH3T3는 doxycycline (tetracycline 유도체)에 의해 투여량에 비례하여 반응정도가 증가하는 양상을 나타내었으며 최대의 반응은 doxycycline 농도가 1 $\mu\textrm{g}$/ml 이상에서부터 관찰되었다. 이 예비실험의 결과를 바탕으로 RevTet-On과 RevTRE-Ltd retrovirus vectyor를 이용하여 사람의 lactadherin 유전자의 유도적 발현을 검정하였는데 CHO 세포에서 lactadherin 유전자의 유도적 발현을 RT-PCR 기법을 이용하여 확인하였다. 표적세포 내에서 외부에서 도입된 유전자가 지속적으로 발현될 경우 심각한 생리적 부작용을 야기시킨다는 사실을 감안할 때 본 실험의 결과는 유전자 치료와 형질전환동물의 생산에 크게 도움이 될 것으로 예상된다.