• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제12권1호
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• pp.77-86
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• 2008

본 연구에서는 LIF의 첨가가 분리된 할구 유래의 생쥐 배아줄기세포 확립에 미치는 영향을 살펴보았다. 과배란 유도된 BDF1 생쥐로부터 2-세포기의 배아를 회수하여 각기 LIF가 첨가되지 않은 배양액과 1,000, 2,500, 5,000 U/mL의 LIF가 첨가된 배양액에서 포배기 배아까지 배양하였다. 배양된 포배기 배아는 차별화 염색 방법을 이용하여 내세포괴와 영양외배엽의 수를 계수하였다. 2,500 U/mL의 LIF 첨가 시 대조군($21.0{\pm}4.0$ vs. $15.9{\pm}5.0$, P<0.01)과 1,000 U/mL의 LIF를 처리한 군($21.0{\pm}4.0$ vs. $16.6{\pm}4.9$, P<0.05)에 비해서 내세포괴의 수가 유의하게(P<0.05) 증가하였다. 배아줄기세포주 확립 배양액으로는 FBS 대신 20% KSR과 0.01 mg/mL의 ACTH를 사용하였다. 2,500 U/mL의 LIF를 첨가 시 배아줄기세포 확립 효율이 36.7%(11/30)로 가장 높은 효율을 나타내었다. 이러한 배양 조건을 기본으로 하여 2-와 4-세포기 배아의 단일 할구를 분리하여 각기 21.4%(3/14)와 4.0%(1/20)의 효율로 단일 할구 배아줄기세포주를 확립할 수 있었다. 단일 할구로부터 확립된 배아줄기세포주와 이들에서 분화된 배아체는 세포면역학적 염색 방법과 RT-PCR 방법을 통해 그들의 미분화 특성과 삼배엽성 분화 특성을 확인할 수 있었다. 결론적으로 배양액에 LIF를 첨가하여 포배기 배아의 내세포괴 수를 증가시킬 수 있었으며, 분리된 할구의 배아줄기세포주 확립 효율을 향상시킬 수 있었다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제12권1호
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• pp.87-95
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• 2008

만능성 인간 배아줄기세포로부터 확립된 신경줄기세포 또는 신경전구세포는 퇴행성 신경질환 세포치료제로 이용될 수 있는 다양한 종류의 신경세포로 분화 유도될 수 있다. 하지만, 인간 배아줄기세포로부터 신경세포를 생산하기 위한 기술은 아직 많은 장애를 가지고 있다. 인간 배아줄기세포 유래 신경전구세포에서 특징적으로 나타나는 신경관 유사로제트에 대한 이해는 인간 배아줄기세포 신경 분화의 효율을 높이는데 유용한 정보를 제공할 것으로 사료된다. 일반적으로 신경로제트(neural rosette)는 분화 중인 배아체를 부착 배양함으로써 유도하지만, 이 방법은 시간이 걸리고 복잡하다는 단점이 있다. 본 연구에서는 신경로제트가 부착배양을 하지 않고 부유배양으로 형성될 수 있는지 조사하였다. 우선적으로, 배아체 형성 및 신경분화에 인간 배아줄기세포 클럼프(clump) 크기가 영향을 주는지를 조사하였고, 사방 $500\;{\mu}m$ 크기의 인간 배아줄기세포 클럼프가 신경 분화 유도에 가장 효과적임을 확인하였다. 로제트 형성을 유도하기 위해, 사방 $500\;{\mu}m$ 크기의 인간 배아줄기세포 클럼프를 1주일 동안 EB 배양배지에 부유 배양함으로써 균일한 크기의 배아체를 얻은 후, NES 배양 배지에서 부가적으로 $1{\sim}2$주 동안 계속 부유 배양한 결과, $7{\sim}10$일 사이에 신경관 유사 로제트가 형성됨을 확인하였다. 로제트 형성 세포의 신경전구세포로서 특성은 RT-PCR과 면역형광염색법을 이용한 신경전구세포 특이적 마커(vimentivi, nestin, MSI1, MSI2, Sox1, Tuj1) 발현을 통해 확인하였다. 또한, 성장인자를 제외한 NES 배양 배지에서 신경로제트를 $2{\sim}6$주 동안 지속적으로 배양하면 성숙 신경세포로의 말단 분화가 유도됨을 확인하였다. 신경세포 특이적 마커(Tuj1, MAP2, GABA)와 신경아교 특이적 마커($S100{\beta}$, GFAP)는 $2{\sim}3$주 또는 4주 후에 각각 발현이 유도됨을 확인하였고, 희소 돌기아교 특이적 마커(O1과 CNPase)는 $5{\sim}6$주 후에 발현이 증가함을 확인하였다. 본 연구결과는 신경로제트가 부유 배양시스템에서 성공적으로 형성됨을 보여주고 있으며, 이는 인간 배아줄기세포의 신경 분화를 이해하고, 신경전구세포 유도 과정을 단순화하는데 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제37권2호
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• pp.99-113
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• 2010

목 적: 최근 다능성을 가진 극소형 줄기세포가 생쥐와 인간에서 발견된다고 보고되었다. 이 연구의 목적은 극소형 추정줄기세포들이 인간 자궁내막에 존재하는지, 그리고 이 세포들이 줄기세포의 고유 특성들과 줄기세포 표지자들을 발현시키는지 확인하기 위함이다. 연구방법: 자궁내막조직검사로부터 채취한 여성 5명의 자궁내막세포를 2주 동안 배양하였으며, alkaline phosphatase, OCT-4, CXCR4 면역화학염색을 통해 줄기세포 표지자 발현 여부를 확인하였다. 이후 percoll density gradient method 방법으로 극소형 추정줄기세포들을 분리하여 배양하였으며, 또한 극소형 추정줄기세포들과 그 유래의 세포들이 OCT-4와 CXCR4를 발현시키는지 확인하였다. 결 과: $3{\mu}m$ 미만의 극소형 추정줄기세포들과 5~15 ${\mu}m$의 과다염색질 원형세포들로 구성된 군집들이 모든 여성의 자궁내막세포에서 발견되었으며, alkaline phosphatase, OCT-4 및 CXCR4를 강하게 발현시켰다. Percoll을 이용하여 극소형 추정줄기세포들을 분리 배양한 결과, 극소형 추정줄기세포들은 자가재생, 배아체양 형성, 군집 형성, 분화 가소성과 같은 줄기세포의 형태학적 및 기능적인 특성들을 나타내었다. 극소형 추정줄기세포들은 세포간 응집 혹은 세포융합을 통하여 약 5~15 ${\mu}m$ 과다염색질 원형세포들과 약 10~20 ${\mu}m$ 구형세포들을 점진적으로 형성시켰다. 이후이 세포들은 섬유아세포 유사세포, 신경유사세포, 혈관내피유사세포를 포함하는 다양한 세포로 분화하였다. 또한 극소형 추정줄기세포들과 극소형 추정줄기세포에서 유래한 세포들은 흔히 OCT-4와 CXCR4를 강하게 발현시켰다. 결 론: 3 ${\mu}m$ 미만의 극소형 추정줄기세포들과 극소형 추정줄기세포에서 유래한 세포들이 인간 자궁내막에서 발견되며, 이 세포들은 줄기세포의 고유 특성들과 줄기세포 표지자인 alkaline phosphatase, OCT-4, CXCR4를 발현시킨다.

• 한국작물학회지
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• 제40권6호
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• pp.757-767
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• 1995

야생종 보리(H. bulbosum)을 이용한 반수체 육종은 보리 육종에 있어서 육종 년한 단축 등 탁월한 육종 효과가 인정되고 있으나 이 방법을 실용화 하기 위해서는 해결해야 할 문제가 많다. 그중에도 종간 교잡에서 얻은 소수의 반수체 배를 안정적으로 보리 육종에 적용하기 위한 system을 개발코자 실시하였다. 이를 위하여 callus 배양을 위한 적정 2,4-D농도와 유기 식물체에 대한 발근촉진에 필요한 적정 IAA농도 선발 및 염색체 배가에 관한 시험에서 얻은 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. Callus유기율은 3ppnm 2,4-D구에서 미성숙 배가 35.6% 성숙 배에서 4.4%였으며, 5ppm구에서 미성숙 배가 33.8%, 성숙 배가5.6%로서 미성숙 배가 성숙 배보다 월등히 높았다. 2. Callus 당 식물체 유기율은 미숙 배에서 6.16개체, 성숙 배에서 5.75 개체로서 Callus를 유도한 배의 성숙도와는 무관하였으며 2,4-D 농도별로는 미성숙배 구에서 3ppm이 5ppm 보다 약간 높은 경향이 었다. 3. 발근 촉진을 위한 IAA농도별 반응 시험에서는 callus에서 유도한 식물체엑서 Ippm, 5ppm구에서 평균 뿌리 길이와 수가 각각 18.4mm, 5.2개와 I5.1mm, 3.9개로 대조구에서의 7.9mm, 3.6개보다 월등히 촉진되었으나, 30ppm에서는 뿌리 길이와 수가 6.4mm, 3.4 개로서 대조구보다 감소되었고 뿌리가 생성될 신초기부에 갈변화 현상이 심하였다. 4. 한편 정상적인 배에서 얻은 식물체에서는 반대로 대조구의 평균 뿌리 길이와 수가 14.8mm,4.9개로서 어느 처리구보다 발근이 좋았으며, IAA 농도가 증가할수록 뿌리 신장이 비례적으로 억제되었다. 5. 반수체의 염색체 배가를 위한 콜히친 처리시송풍 효과를 본 바, 낮은 온도(15$^{\circ}C$)에서는 효과가 크게 인정되었으나 높은 온도($25^{\circ}C$)에서는 배가의 효과없이 식물체 고사율만 증가시켰다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제6권1호
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• pp.55-66
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• 2002

배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC)는 미분화상태로 지속적인 계대가 가능하며, 정상 핵형과 전 분화능(pluripotency)을 가져 생체내-외에서 분화 유도시 삼배엽성의 모든 세포로 분화 가능하다. ESC를 feeder 세포 없이 부유배양하면 배아체(embryoid body, EB)를 형성하고, 초기 배아 발생과 유사한 분화 양상을 갖는다. ESC의 분화 유도가 초기배아 발생처럼 생식호르몬(GTH: FSH, LH; steroids)의 영향을 받는지는 불명하다. 본 연구는 ESC가 분화과정중 생식호르몬처리에 의해 그들 수용체가 발현되는가를 알아보고자 하였다. 순계혈통 생쥐인 C57BL/6J에서 과배란 유도후 포배를 수획하고, 유사분열적으로 불활성화된 feeder 세포와 공배양하여, 계대배양 하는 중 배아줄기세포주(JHYl)를 확립하였다. JHY1의 alkaline phosphatase 활성과 SSEA-1, 3, 4 발현을 통해 ESC임을 확인하였다. Feeder 세포 없이 ESC를 계대배양 후 호르몬처리(FSH LH E$_2$, P$_4$, T)하에서 5일 동안 부유배양하여 배아체를 형성시키고, 이후 7일 동안 부착배양하여 분화를 유도하였다. GTH와 스테로이드의 수용체 발현 실험에서 ESC에 E$_2$ 처리에 의한 LHR의 발현 증가를 제외한 나머지 호르몬 처리군에서 ESC보다 낮은 생식호르몬의 수용체 발현이 관찰되었다. 생식호르몬을 농도별 수용체 발현 정도는 증감되지 않았다. 미분화 ESC 표지유전자인 Oct-4는 호르몬 처리군에서도 발현되었다. 각 배엽의 표지유전자들(영양세포, handl; 외배엽성, keratin와fgf-5; 중배엽성, enolase와 $\alpha$ -globin; 내배엽성, gata-4와 $\alpha$ -fetoprotein) 등의 발현 양상을 조사한 결과 호르몬 처리후 내배엽성 표지유전자외에는 발현 증가가 관찰되지 않았다. 즉 생식호르몬에 의해 gata-4, $\alpha$-fetoprotein의 발현이 증가되는 것으로 보아 내배엽성 계열로의 분화 유도가 이루어진 것으로 사료된다.

• 한국산림과학회지
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• 제13권1호
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• pp.25-39
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• 1971

약배양(葯培養)에 의(依)한 반수체식물(半數體植物)의 유기(誘起)가 돌연변이(突然變異), 유전학등(遺傳學等)의 기초연구(基礎硏究)나 실지육종사업(實地育種事業)에 혁신(革新)을 갖져올 수 있다는 사실(事實)이 알려지자 최근(最近) 2-3년간(年間) 이에 대(對)하여 많은 연구(硏究)가 시도(試圖)되었지만 현재(現在)까지 성공(成功)된 식물(植物)의 종류(種類)는 수종(數種)에 불과(不過)하다. 식물(植物)의 여러조직배양법(組織培養法) 중(中)에서도 약배양(葯培養)이 특(特)히 힘든것은 이 경우(境遇)에는 환원소포자(還元小胞子)에서 Callus가 embryoid를 유기(誘起)하여야만 되기 때문이다. 과수(果樹)와 화목류(花木類) 4속(屬) 7종(種)의 식물(植物)을 대상(對象)으로 약배양(葯培養)을 시도(試圖)하였다. 배양약(培養葯)은 대개(大槪) 4분자(分子)에서 늦은 소포자기(小胞子期)의 것을 혼합(混合)하여 사용(使用)하였고 배양기(培養基)는 Modified murashige and skoog의 배지(培地)를 기본배지(基本培地)로 하고 여기에 NAA, $2{\cdot}4$-D, YE, Kinetin등(等) 생장조절물질(生長調節物質)을 농도(濃度)와 조합(組合)을 달리한것을 첨가(添加)하여 만들었다. 재료(材料)의 취급(取扱), 멸균배양(滅菌培養)에 따른 여러조작(操作), 조직표본작성등(組織標本作成等) 모든것은 상법(常法)에 의(依)하였다. 이제 성적(成績)을 요약(要略)하면 다음과 같다. 1. Callus는 개나리, 진달래, 산철쭉, 살구 등(等)에서 형성(形成)되었고 복숭아, 배, 자두에서는 안생긴다. 2. Auxin Kinetin의 종류(種類)와 농도(濃度)를 달리한 여러 배양기(培養基)를 사용(使用)하였지만 Callus형성(形成)은 어느 것에서나 잘된다. 3. 개나리에서는 Callus는 약표면(葯表面), 약격부위(葯隔部位)에서 체세포기원(體細胞起源)의 2배성(倍性) Callus가 생기고 소포자(小胞子)에서는 안생긴다. 오래 배양(培養)된 소포자(小胞子)에서는 대부분(大部分) 전분(澱粉)이 축적(蓄積)된다. 4. 진달래에서는 화사(花絲), 약격(葯隔), 약내동(葯內童) 등(等)에서 체세포성(體細胞性) Callus가 형성(形成)되고 소포자기원(小胞子期源)의 Callus는 안생기고 소포자(小胞子)에는 전분(澱粉)이 축적(蓄積)된다. 5. 산철쭉은 Callus형성(形成)이 화사(花絲), 약격등(葯隔等)에서도 생기지만 주(主)로 화사반대편(花絲反對便)의 약이첨단(葯耳尖端)에서 잘생긴다. 소포자기원(小胞子期源)의 Callus는 안생기고 소포자(小胞子) 전분(澱粉)이 축적(蓄積)되는 점(點)은 진달래와 같다. 6. 살구는 체세포성(體細胞性) 약조직기원(葯組織起源)의 Callus는 거이 안생기고 Callus는 약강내부(葯腔內部)에서 형성(形成)되어 약봉합부(葯縫合部)를 헤치고 나온다. 오래 배양(培養)된 소포자(小胞子)에도 전분(澱粉)은 축적(蓄積)되지 않는다. 7. 복숭아, 배, 자두 들에서는 60여일배양(餘日培養)된 약(葯)의 어느 부위(部位)에서도 Callus는 형성(形成)되지 않는다. 반면(反面) 소포자(小胞子)에 전분축적(澱粉蓄積)도 안되는것이 특징(特徵)이다. 8. 체세포(體細胞) Callus는 주(主)로 약벽내피(葯壁內被), 두 약강(葯腔)사이의 격막(隔膜), 약격(葯隔) 및 약이유조직등(葯耳柔組織等)에서 생긴다. 9. 살구의 약조직(葯組織)은 배양중(培養中) 별(別)로 변화(變化)가 안되지만 소포자(小胞子)는 변화(變化)하야 다핵소포자(多核小胞子), 다조포체(多組胞體)들이 약강내(葯腔內)에 출현(出現)한다. 이런 현상(現像)은 살구의 Callus는 소포자기원(小胞子期源) 이라는것을 표시(表示)해준다. 10. 7종(種)의 식물중(植物中) 살구만은 환원성(還元性) 소포자(小胞子) Callus가 생기고 기타(基他)의 식물(植物)들은 약(葯)의 체세포성(體細胞性) 조직(組織)에서 Callus가 형성(形成)되기 때문에 반수체육종(半數體育種)의 가능성(可能性)은 살구에서만 있다.