• 한국작물학회지
• /
• 제40권6호
• /
• pp.757-767
• /
• 1995

야생종 보리(H. bulbosum)을 이용한 반수체 육종은 보리 육종에 있어서 육종 년한 단축 등 탁월한 육종 효과가 인정되고 있으나 이 방법을 실용화 하기 위해서는 해결해야 할 문제가 많다. 그중에도 종간 교잡에서 얻은 소수의 반수체 배를 안정적으로 보리 육종에 적용하기 위한 system을 개발코자 실시하였다. 이를 위하여 callus 배양을 위한 적정 2,4-D농도와 유기 식물체에 대한 발근촉진에 필요한 적정 IAA농도 선발 및 염색체 배가에 관한 시험에서 얻은 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. Callus유기율은 3ppnm 2,4-D구에서 미성숙 배가 35.6% 성숙 배에서 4.4%였으며, 5ppm구에서 미성숙 배가 33.8%, 성숙 배가5.6%로서 미성숙 배가 성숙 배보다 월등히 높았다. 2. Callus 당 식물체 유기율은 미숙 배에서 6.16개체, 성숙 배에서 5.75 개체로서 Callus를 유도한 배의 성숙도와는 무관하였으며 2,4-D 농도별로는 미성숙배 구에서 3ppm이 5ppm 보다 약간 높은 경향이 었다. 3. 발근 촉진을 위한 IAA농도별 반응 시험에서는 callus에서 유도한 식물체엑서 Ippm, 5ppm구에서 평균 뿌리 길이와 수가 각각 18.4mm, 5.2개와 I5.1mm, 3.9개로 대조구에서의 7.9mm, 3.6개보다 월등히 촉진되었으나, 30ppm에서는 뿌리 길이와 수가 6.4mm, 3.4 개로서 대조구보다 감소되었고 뿌리가 생성될 신초기부에 갈변화 현상이 심하였다. 4. 한편 정상적인 배에서 얻은 식물체에서는 반대로 대조구의 평균 뿌리 길이와 수가 14.8mm,4.9개로서 어느 처리구보다 발근이 좋았으며, IAA 농도가 증가할수록 뿌리 신장이 비례적으로 억제되었다. 5. 반수체의 염색체 배가를 위한 콜히친 처리시송풍 효과를 본 바, 낮은 온도(15$^{\circ}C$)에서는 효과가 크게 인정되었으나 높은 온도($25^{\circ}C$)에서는 배가의 효과없이 식물체 고사율만 증가시켰다.

• Reproductive and Developmental Biology
• /
• 제28권2호
• /
• pp.119-126
• /
• 2004

본 실험은 돼지체외수정란을 생산하는데 적합한 배양액과 산소조건을 구명하기 위하여 NCSU(North Carolina State University)-23, PZM(Porcine Zygotes Medium)-3, PZM-4 및 TCM(Tissue Culture Medium)-199 배양액과 5% 산소조건(39, 5% $O_2$, 5% $CO_2$ , 90% $N_2$ 및 포화습도) 및 20% 산소조건(39, 5% $CO_2$ 및 포화습도)에서 돼지 미성숙난포란의 체외성숙과 체외배발달을 실시하였다. 본 연구에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 돼지 난포란을 5 및 20% 산소조건하에서 NCSU-23, PZM-3, PZM-4 및 TCM-199 배양액에 44시간 동안 성숙을 유도한 결과 난핵포붕괴율과 핵성숙률에 있어서 산소조건 및 배양액간 유의적(p>0.05)차이는 없었다. 2) 체외수정을 실시한 결과 정자 침투율, 자ㆍ웅전핵형성률, 다정자 침입률 및 평균정자수에 있어서 산소조건 및 배양액간에 유의적인 차이가 없었다. 3) 체외수정을 실시한 후, 5 및 20% 산소조건의 NCSU-23, PZM-3, PZM-4 및 TCM-199 배양액에서 배양하여 배발달에 미치는 영향을 조사한 결과, 난할률에 있어서는 유의적(p＜0.05)인 차이가 없었으며. 배발달 7일째 배반포기 발달률에 있어서 5% 산소조건에서는 PZM-3 배양액이, 20% 산소조건에서는 NCSU-23 배양액이 유의적(p＜0.05)으로 높은 결과를 나타냈다. 4) 배발달 7일째 배반포기 배의 세포수를 조사한 결과, 내부세포괴세포수와 총세포수는 산소조건과 배양액간에 통계적인 유의성이 인정되지는 않았으나, 5% 산소조건에서 PZM-3 배양액(36.8$\pm$6.5개)이 다소 높은 총세포수를 나타냈다. 위의 결과를 종합하면 돼지체외수정란의 생산에는 5% 산소조건에서 PZM-3 배양액에서 배발달을 유도하는 것이 배반포기 발달률과 세포수에 있어 효과적이라고 판단된다.

• Current Research on Agriculture and Life Sciences
• /
• 제4권
• /
• pp.27-35
• /
• 1986

Rhizobium의 Nitrogenase 생성요인(生成要因)과 감염기작(感染機作)을 구명(究明)하고 배양세포(培養細胞)와 Rhizobia의 혼합배양(混合培養)에서 질양고정계(窒養固定係)를 확립(確立)하기 위(爲)하여 황금(黃金), 남천(南川), D68-0099등(等) 세 품종(品種)을 조직배양(組織培養)한 결과(結果)는 다음과 같다. Callus 형성능(形成能)은 배(胚)와 유근(幼根)에서는 양호(良好)하나 배축(胚軸)에서는 전혀 없었으며 2mg/${\ell}$ 2,4-D, 4mg/${\ell}$ NAA에서 가장 양호(良好)하고 2,4-D/Kinetin 조합농도(組合濃度)에서는 0.2mg(2,4-D)/${\ell}$과 0.05mg(Kinetin)/${\ell}$에서 가장 이상적(理想的)이었다. 배양세포(培養細胞)의 성장(成長)에는 2,4-D 2mg/${\ell}$와 2,4-D (0.2mg/${\ell}$)/Kinetin(0.05mg/${\ell}$)일 때가 가장 양호(良好)하며 R. japonicum 019, 011을 접종(接種)하였을때 배양세포(培養細胞)의 성장(成長)은 상당히 둔화되었다. 단일(單一) 아미노산은 배양세포(培養細胞)의 성장(成長)을 저해(沮害) 하였는데 황금(黃金)의 경우 Methionine, Leucine에서 저해(沮害)가 가장 컷으며 다른 아미노산의 첨가(添加)로 저해작용(沮害作用)이 상당히 회복되었다. 부정근(不定根)의 생성(生成)은 2,4-D 2.0mg/${\ell}$에서나 0.2mg/${\ell}$ 2, 4-D/0.05mg/${\ell}$ Kinetin에서 양호(良好)하였다. 배양세포(培養細胞)-Rhizobium의 친화(親和)에 의(依)한 질소고정력(窒素固定力)은 25개(個) 사용(使用) 균주중(菌株中)에서 황금(黃金)에서는 10개(個) 균주(菌株), 남천(南川)에서는 7개(個) 균주(菌株)에서 나타났으며 D68-0099에서는 전혀 나타나지 않았으며 황금(黃金)의 경우(境遇) 85-HG-1 019, 007, 남천(南川)에서는 007, 119등(等)이 높은 활성(活性)을 나타내었다.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제19권2호
• /
• pp.185-189
• /
• 2004

본 연구는 호랑이 미성숙 난자의 체외 성숙의 가능성을 검토하였다. 1. 호랑이 난자의 직경 (176.5${\pm}6.1{\mu}m$)은 소 난자의 직경 (150.7${\pm}4.9{\mu}m$)보다 유의적으로 컷으며, 세포질 직경 (122.1${\pm}9.7{\mu}m$) 은 소 난자의 직경 (118.7${\pm}7.5{\mu}m$) 과 유의차가 없었다. 또한, 호랑이 난자의 투명대 두께 (20.4${\pm}2.9{\mu}m$) 는 소 난자의 두께 (12${\pm}2.6{\mu}m$) 보다 유의적으로 두꺼웠다(p<0.05). 2. 체외성숙 48시간째 제1극체의 출현율은 62.5%이며, 핵성숙은 GV 단계(12.5%)와 MII 단계(50.0%)의 핵 성숙율을 보였다. 이상의 연구결과로 보아 호랑이 난자도 체외성숙이 가능하리라 판단되며 보다 더 적합한 체외성숙조건의 검토가 요구된다.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제19권2호
• /
• pp.155-163
• /
• 2004

본 연구는 도축돈의 난소로부터 난자를 채취하여 체외배양시킨 후 세포 안정제와 원심분리 그리고 OPS를 이용한 유리화동결 하였다. 동결 융해한 수정란을 경산돈에 외과적 또는 비외과적으로 이식하여 자돈을 생산하는 것을 목적으로 수행하였다. ${\cdot}$ 도축돈 난소로부터 채란되어진 돼지 미성숙난은 Funahashi 등(1994) 방법에 따라 체외 성숙-수정-배양하였다. 체외배양액은 glucose-free NCSU 23을 이용하였으며, 5일째에 10% Fatal bovine serum (FBS)을 첨가 배반포로 발달을 유도하였다. ${\cdot}$ 체외배양된 수정란은 7.5${\mu}$g.mL cytochalasin B에 30분 처리 후 13,000 rpm에 13분간 원심 분리하였고, ethylene glycol(EG) 동결액으로 처리한 뒤 OPS를 이용하여 동결${\cdot}$융해하였다. ${\cdot}$ 동결수정란과 비동결수정란을 plastic straw에 loading 한 후 3두에는 경산돈에 외과적 방법으로 각각 100개, 100개의 동결수정란과 대조군으로 34개의 비동결수정란을 이식하였고 다른 3두에는 비외과적 방법으로 각각 150개, 150개의 동결수정란과 대조군으로 100개의 비동결수정란을 각각 이식하였다. 외과적이식돈의 대조군에 사용한 신선수정란은 비경산돈 3두에서 채란하였다. ${\cdot}$이식 결과 6두 모두 지연성 발정을 보였으며 이중 동결수정란 이식돈은 임상적으로 정상이였으나 비동결수정란은 이식한 경우는 자궁내막염과 복강탈장이 관찰되었다. 주요 원인은 시술시 기술의 미숙과 야외수술에 의한 감염, 난자의 이동과 수송에 의한 영향 그리고 주입 미숙 등이 주요 원인인 것으로 생각되며 융해 후 생존효율이 높은 수정란의 준비, 이식 기술의 개선과 자궁상태가 청결한 비경산돈의 이식으로 임신율을 높일 수 있을 것으로 기대된다.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제16권3호
• /
• pp.213-221
• /
• 2001

본 연구는 복제 돼지의 생산성 향상과 형질전환에 의한 대체상기용 복제 돼지 생산에 기여하기위한 기초연구로 공여세포의 조건, 핵이식 수정란의 융합 및 활성화와 체외발달에 미치는 각종 요인들은 조사하였다. 공여세포는 생후 10개월 된 Landrace 종으로부터 귀 세포조직(5$\times$5mm)을 채취하여 0.05%의 trypsin과 EDTA가 첨가된 D-PBS로 세포를 분리하여 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액으로 계대배양을 실시하여 사용하였다. 핵이식은 laser system 으로 투명대를 drilling하여 수핵난자의 극체와 핵을 제거한 후 공여세포를 주입하였으며. 핵이식란은 DC 1.9kv/cm, 30$\mu$sec 1회의 전기자극으로 융합과 1시간 후 AC 1.50kv/cm, 30$\mu$sec 1회의 조건으로 활성화를 실시하여 분할을 유도하였다. 분할된 핵이식 수정란은 10% FBS가 첨가된 NCSU-23 배양액으로 $CO_2$배양기에서 6~8일 동안 체외배양을 실시하여 배반포기로 발달한 수정란을 Hoechst 33342로 핵염색을 하여 할구수를 조사하였다. 공여세포의 기아배양을 3~4 및 5~6 일간 실시하여 핵이식 후 전기자극으로 융합을실시하였을 때 융합율은 각각 45.6 및 36.8%로써 기아배양 기간에 따른 차이는 없었다. 융합 및 활성화가 유기된 핵이식란의 분할율은 3~4일간 기아배양을 실시한 공여세포가 67.1%로써 가장 높았으며(P<0.05), 5~6일간 기아배양을 실시한 공여세포의 57.1%와는 차이가 없었다. 공여세포를 1~2, 5~6 및 13~14대 계대배양한 것을 사용한 핵이식란의 융합율은 각각 52.7, 53.0 및 51.7%로써 차이가 없었다. 융합이 이루진 핵이식란을 활성화를 유도했을 때 1~2, 5~6 및 13~14대 계대배양한 공여세포의 분할율도 각각 42.7, 46.8 및 45.5%로써 차이가 없었다. 25$\mu$m$\geq$ 크기의 공여세포를 사용하였을 때 핵이식란의 융합율은 65.3%로써 25~30$\mu$m 및 30$\mu$m $\leq$ 크기 공여세포의 융합율 42.5 및 45.5% 보다는 유의적(P<0.05)으로 높았다. 융합과 활성화가 유기된 핵이식란의 분할율은 25$\mu$m $\geq$, 25~3o$\mu$m 및 30$\mu$m $\leq$ 크기에서 각각 56.5, 68.8 및 58.5%로써 공여세포의 크기에 따른 분할율은 유의적인 차이가 없었다. 체외수정란과 체세포 핵이식 수정란의 발달에 있어서는 분할율이 각각 80.1%와 64.0%로써 핵이식 수정란이 체외수정란 보다 낮았으나, 배반포기로의 발달율에 있어서는 각각 12.4%와 10.5%로써 차이가 없었다.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제16권3호
• /
• pp.203-211
• /
• 2001

성간별에 이용할 돼지 수정란을 체외수정 방법으로 생산하기 위하여 돼지 난소에서 채취한 난자를 NCSU 23 배지에서 eCG, hCG를 첨가한 상태에서 22시간, 첨가하지 않은 상태에서 22시간 체외성숙을 시킨 후 mTBM을 이용하여 여러가지 정자농도(5$\times$$10^4$, 2.5$\times$$10^{5}$ , 6.0$\times$$10^{5}$ 그리고 10.0$\times$$10^{5}$ )에 따라 6시간 수정시켰고, NCSU 23 배지에서 배양시켰다. 배양 후 44시간에 수정란의 분할률을 관찰하였고, 144시간에 배반포 형성율을 확인하였다. 성감별 방법은 체외수정으로 생산된 배반포를 돼지 Y-specific DNA primer를 이용하여 PCR 처리를 한 후 전기영동으로 491 bp에서 증폭된 band의 유무에 따라 암컷과 수컷의 성을 판정하였다. 1. 돼지 체외수정에서 정자농도 5$\times$$10^4$, 2.5$\times$$10^{5}$ , 6.0$\times$$10^{5}$ 및 10.0$\times$$10^{5}$ 에 따른 수정란 분할률은 각각 55.95, 67.88, 60.18, 47,60%이었다. 2. 정자농도 5$\times$$10^4$, 2.5$\times$$10^{5}$ , 6.0$\times$$10^{5}$ 에 따른 배반포 형성율은 각각 16.03, 22.40, 21.41, 12.37%이었다. 3. 31개의 체외수정으로 생산된 배반포에 대한 PCR을 이용한 성감별 결과는 18개가 수컷, 13개가 암컷으로서 각각 58.1%과 41.9%를 나타내었다. 이상의 결과로 보아 돼지의 체외수정으로 생산된 배반포에 대한 성감별시 PCR 기법이 신속하고 정확하게 성감별을 실시할 수 있는 방법으로 판단되었다.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제22권2호
• /
• pp.89-95
• /
• 2007

본 연구는 재래 산양의 체세포 핵이식에 의하여 생산한 복제 산양(진순이)의 조직으로부터 공여 핵을 배양하여 다시 핵이식을 실시하여 재복제에 따른 융합율과 분할율, 이식 후의 수태율 등을 조사하여 재복제 가능성 여부를 검토하기 위하여 실시하였다. 공여 세포는 귀 유래 섬유아세포를 분리 배양하여 사용하였으며, 체내 성숙 난자는 성숙한 미경산 재래 산양에 과배란을 유기하여 외과적인 방법으로 난관 관류를 통해 회수하여 핵이식을 실시하였다. 핵이식란의 융합은 전기 자극 방법으로 실시되었으며, 융합이 완료된 핵이식란의 활성화 처리는 핵이식 3시간 후에 Ionomycin과 6-DMAP를 병용 처리하여 실시하였다. 복제 수정란의 체외 배양은 0.8% BSA가 첨가된 mSOF 배양액으로 $2{\sim}4$ 세포기까지 체외 배양을 실시한 다음 수란 산양의 난관에 외과적으로 이식하였다. 임신 진단은 발정일로 부터 제 30일과 60일째에 초음파 임신 진단기로 임신 진단을 실시하고, Progesterone농도는 이식 후 21일째와 63일째의 혈액을 채취하여 RIA 방법으로 검사하였다. 체세포 핵이식에 의한 재복제란(2nd)을 전기 자극에 의한 융합을 1회 실시하였을 때 융합율은 65.9%로서 복재란(1st)의융합을 51.0%보다 유의적(p<0.05)으로 높았으며, 2회 전기자극을 실시하였을 때는 각각 77.4 및 63.9%로서 차이가 없었으나, 3회 재복제란 융합율도 87.5%로서 복제란의 70.1%와 유의적인 차이는 없었다. 재복제 융합란의 분할율은 56.0%로j 복제 융합란의 77.7%보다 낮았다. 재복제란을 수란 산양에 이식을 실시하여 임신 제21일과 63일째 임신 진단을 실시하였을 때 수태율을 수란 산양의 발정유기 방법에 따른 수태율에 있어서 재복제란의 21일째 수태율은 39.3%로서 복제란의 17.4%보다 높았으며, 63일째는 각각 14.3 및 13.0%로서 복제 회수에 따른 수태율의 차이는 없었다. 수란 산양의 발정 유기 방법에 있어서 제 21일째에 자연발정이 발현된 수란 산양의 수태율은 45.4%로서 인위적으로 발정 동기화를 유도한 수란 산양의 35.3%보다 높았다. 제 63일째는 각각 18.2 및 11.8%로서 차이가 없었다. 이상의 결과로 볼 때 재래 산양의 체세포 핵이식에 의한 복제효율에 있어서는 복재와 재복제간에 차이가 없었으며, 수란산양의 발정 동기화 방법에 따른 수태율에 있어서도 차이가 없었다. 그러나 앞으로 재래 산양의 복제 효율 개선을 위해서는 양질 난자의 다량 확보, 산양 수정란의 체외 배양 체계 확립, 이식 기법의 개발 등에 관한 후속 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제19권1호
• /
• pp.43-51
• /
• 2004

본 연구에서는 체세포를 이용한 돼지 복제수정란의 생산효율을 높이는 최적의 방법을 구명코자 핵이식 수정란에 각기 다른 조건들의 전기적 자극에 의한 융합과 활성화를 유도하여 융합율, 분할율, 후기배로의 발달율 및 배반포기배의 할구수를 비교ㆍ조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 핵이식 복제 수정란과 전기자극에 의한 단위발생란과의 체외배양후 분할율을 비교한 결과 두 처리간에 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, 배양7일째 배반포기배로의 발달율에 있어서는 복제수정란이 7.6%로 나타나 단위발생란의 20.4%에 비해 낮은 후기배로의 발달율을 나타내었다. 핵이식 수정란의 전기적 융합에 있어서 각기 다른 전기자극의 조건에 따른 융합율과 분할율 그리고 후기배로의 발달율에 있어서 110 V/mm의 전기적 자극이 주어진 군에서는 47.1%로 나타나 130 V/mm의 자극과 150 V/mm의 자극이 주어진 두 군에서의 70.2%와 72.6%에 비해 낮은 융합율을 나타내었고, 분할율에 있어서도 각각 48.6%, 72.6%와 70.5%로 나타나 110 V/mm의 자극이 주어진 군에서 두 처리군보다 낮은 성적을 나타내었다. 그러나 배반포기배로의 발달율에 있어서는 각각의 처리군에 있어서 8.1%, 9.7% 및 10.7%로 나타나 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 체세포를 이용한 핵이식수정란의 전기적 자극에 의한 융합과 활성화에 있어서 3가지의 각기 다른 처리군(A type, SA 방법; B type, SA 방법과 CB 처리군; C type, DA 방법과 CB 처리군)으로 나누어 조사한 결과 3가지의 처리군에 있어서의 분할율은 각각 71.4%, 74.7% 및 70.8%로 나타나 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 배반포기배로의 발달율에 있어서도 각각 9.7%, 8.0% 및 11.2%로 나타나 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 또한 배반포기배의 할구수에 있어서도 3가지 처리군에서 각각 22.5$\pm$12.8, 23.3$\pm$11.2 및 21.6$\pm$10.4로 나타나 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 이상의 실험 결과들을 종합해 보면, 본 연구에서는 돼지의 체세포를 이용한 핵이식 수정란의 융합시 130 V/mm 또는 150 V/mm, 50 ${\mu}\textrm{s}$ec, 2 pul-se의 전기적 강도를 이용하고, 활성화 방법으로는 SA 방법 또는 DA 방법을 병행한다면 복제수정란의 생산효율을 향상시킬 수 있음을 시사하였다. 따라서 돼지의 체세포를 이용한 복제수정란의 생산효율을 향상시키기 위해서는 핵이식 수정란의 전기적 자극에 의한 융합과 활성화에 관한 조건이 확립되어야 하며, 또한 후기배로의 발달율 향상을 위한 최적의 체외배양조건이 확립되어야 할 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제22권1호
• /
• pp.27-32
• /
• 2007

본 연구는 소 체외 수정란의 팽창 및 hatching시 prostaglandin $F_2{\alpha}(PGF_2{\alpha})$와 prostaglandin $E_2(PGF_2)$의 영향에 대하여 검토하였다. 체외 수정란의 체외 배양시 다음과 같이 (1) 0, 1, 10 및 100ng/ml $PGF_2{\alpha}$, (2) 0, 1, 10 및 100ng/ml $PGE_2$, (3) low $PGF_2{\alpha}$(1ng/ml : 1ng/ml), (4) low $PGF_2{\alpha}\;:\;high\;PGE_2(1ng/ml\;:\;10ng/ml)$, (5) high $PGF_2{\alpha}\;:\;low\;PGE_2$ (10ng/ml : 1ng/ml), (6) high $PGF_2{\alpha}$ : high $PGE_2$(10ng/ml : 10ng/ml)로 나누어 처리하였다. 그 결과, $PGF_2{\alpha}$ 및 $PGE_2$의 단독 처리가 소 체외 수정란의 배반포로의 발달에는 영향을 미치지는 않았다. 그러나 10ng/ml $PGE_2$(10.3%) 그리고 1ng/ml $PGF_2{\alpha}$ : 10ng/ml $PGE_2$(22.2%)를 처리한 수정란의 hatching율에 있어서는 대조군(4.3% and 12.7%)이나 다른 처리구에 비하여 유의적으로 높은 결과를 나타냈다(P<0.05). 한편 높은 농도의 $PGF_2{\alpha}$를 처리한 수정란의 경우 hatching율이 감소하였다. 따라서 본 연구의 결과는 $PGF_2{\alpha}$ 및 $PGE_2$의 첨가가 소 수정란의 hatching율과 관련이 있으며, 이것은 농도에 따라 서로 다른 영향을 미칠 수 있을 것으로 추측되었다.