• 상하수도학회지
• /
• 제23권2호
• /
• pp.199-205
• /
• 2009

It is very important to differentiate of DNA derived from live or dead bacteria within mixed microbial communities in aquatic environments. Ethidium monoazide (EMA) is a DNA intercalating agent and the treatment of EMA with strong visible light cleaves the genomic DNA of bacteria. In dead bacterial cells, EMA intercalates into the genomic DNA, induces the cleavage of DNA, and inhibits the PCR amplification. In this study, we developed the EMA-PCR and EMA real-time PCR to detect the DNA derived from viable Escherichia coli (E.coli) in mixed cultures of live and dead E.coli. The treatment of EMA, $50{\mu}g/mL$, and 650 W visible halogen light exposure for 2 minutes cleaved the genomic DNA derived from heat killed E.coli but did not those of live E.coli. EMA-PCR could detect the DNA from live E.coli in mixed culture samples of live and dead E.coli at various ratio and there was no DNA amplification in only dead E.coli cultures. Similar results were observed in EMA real-time PCR. Further studies are needed to develop various EMA-PCR methods to detect viable waterborne pathogens such as Helicobacter pylori, Giardia lamblia, and so on.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제8권6호
• /
• pp.669-675
• /
• 1998

Taq DNA polymerase exhibits a sizable drawback compared to the other thermophilic DNA polymerases in that it demonstrates lower proof-reading activity due to the deficiency of 3'-5'exonuclease activity. A study was undertaken to improve the 3'-5' exonuclease activity in the PCR of Taq DNA polymerase. The three-dimensional structural alignment of the polymerase and 3'-5' exonuclease domains from the pol I family DNA polymerases explains why Taq DNA polymerase has just a background level of 3'-5'exonuclease activity. A comparison indicated that the two polymerase domains are very similar in primary and tertiary conformations, even though Taq DNA polymerase carries a much shorter 3'-5'exonuclease domain than that of E. coli DNA polymerase I. Those two polymerase domains were interchanged between Taq DNA polymerase and E. coli DNA polymerase I. The 3'-5' exonuclease domain from E. coli DNA polymerase I was separated and pasted into the polymerase domain of Taq DNA polymerase I, which resulted in a functional fusion-Stoffel fragment. The 3'-5'exonuclease activity of the fusion-Stoffel fragment increased up to 48% of the value of the Klenow fragment, while that of Taq DNA polymerase remained at 6.0% of the Klenow fragment.

• 미생물학회지
• /
• 제32권1호
• /
• pp.47-52
• /
• 1994

Campylobacter jejuni에 48${\circ}C$의 열충격을 30분간 주었을 때, HSP90, HSP66, HSP60의 열충격 단백질들이 합성되었고, 이 단백질들은 각각 E. coli의 hsp87, HSP66 (DnaK), HSP58(GroEL)에 상응하는 단백질들이었다. 여러가지의 제한효소로 처리한 C. jejuni의 chromosomal DNA에 E. coli의 groEL(4.0kb)을 probe로 사용하여 Southern hybridization한 결과, 이들과 상동성을 가지는 유전자들이 있음을 확인하였다. C. jejuni의 groEL 유전자를 pWE15 cosmid를 이용하여 recombinant plasmid pLC1을 만들고, 이를 E. coli B178 groEL44 ts mutant에 형질전환시켜 E. coli LC1을 얻었다. 이 pLC1에는 groEL 유전자가 존재하는 5.7kb인 insert DNA가 포함되어 있었고, 그로부터 subcloning한 pLC101에는 groEL을 포함하는 4.0kb의 DNA가 삽입되어 있었다. 이 recombinant plasmid들이 형질전환된 E. coli LC1과 LC101 균주에서는 C. jejuni의 GroEL 단백질이 과다 생산되었다. C. jejuni의 groEL이 cloning된 E. coli LC1은 42${\circ}C$에서의 생장능력이 회복되었고, ${\lambda}$ vir phage에 대한 감수성도 회복되는 등의 chaperon 효과가 입증되었다.

• 한국식물병리학회지
• /
• 제14권2호
• /
• pp.164-170
• /
• 1998

This study was carried out to develop DNA probe for specific detection of Erwinia carotovora subsp. carotovora. Universal rice primer (URP, 20 mer) developed from repetitive sequence of rice was applied for producing PCR DNA fingerprints of Erwinis spp. In E. carotovora subsp. carotovora strains, primer URP2F amplyfied polymorphic bands which are distinguisable from other Erwinia spp. A PCR band of 0.6 kb selected from PCr polymorphic bands of E. carotovora subsp. carotovora strains was cloned and evaluated as a diagnostic DNA probe. Among 28 bacterial strains including 22 Erwinia spp, the probe (pECC2F) only hybridized to total DNAs from e. carotovora subsp. carotovora strains and E. carotovora subsp. wasabiae, but sizes of hybridized bands were different between these subspecies, 10.0 kb and 3.5 kb respectively. In dot blot assays using probe pECC2F, as few as 103 colony forming units (CFU) of E. carotovora subsp. carotovora could be detected in a suspension containing about 1$\times$103 CFU of soil bacteria.

• Journal of Nutrition and Health
• /
• 제40권8호
• /
• pp.708-718
• /
• 2007

본 연구는 비타민 E의 보충섭취가 폐경기 여성의 항산화 영양상태 및 임파구 DNA 손상을 개선할 수 있는지를 알아보고자 수행되었으며, 이중맹검법으로 실시되었고 플라시보를 위약군으로 하였다. 폐경기 여성 35명을 대상으로 6주 동안 비타민 E 보충섭취군에게는 비타민 E 캡슐($\alpha$-tocopherol 성분 400 IU/capsule)을, 위약군에게는 대두유로 만든 위약 캡슐(400 mg/capsule)을 하루 2회 섭취하도록 하였으며, 이 때 두 군의 분류는 무작위로 하였다. 항산화 영양상태를 알아보기 위해 혈장 vitamin C, $\alpha$-tocopherol, $\gamma$-tocopherol, $\alpha$-carotenoid, $\beta$-carotenoid, lycopene 농도를 측정하였고, 임파구 DNA 손상정도를 알아보기 위해서는 Comet assay를 이용하여 tail length, %DNA in tail, tail moment를 측정하였다. 비타민 E 보충섭취군에서는 혈장 vitamin C(p<0.05)와 $\alpha$-tocopherol(p<0.000)농도가 유의적으로 증가하였고, $\gamma$-tocopherol(p<0.000) 농도와 tail length(p<0.05)는 유의적으로 감소하였다. 반면, 위약군에서는 혈장 vitamin C(p<0.05)의 농도만이 유의적으로 증가하였다. 결론적으로, 본 연구는 비타민 E의 보충섭취가 혈장 항산화 상태 및 DNA 손상에 대해 부분적인 개선 효과가 있음을 보여주었다.

• BMB Reports
• /
• 제36권1호
• /
• pp.12-19
• /
• 2003

Fragmentation of purine imidazole ring and production of formamidopyrimidines in deoxynucleosides (Fapy lesions) occurs upon DNA oxidation as well as upon spontaneous or alkali-triggered rearrangement of certain alkylated bases. Many chemotherapeutic agents such as cyclophosphamide or thiotepa produce such lesions in DNA. Unsubstituted FapyA and FapyG, formed upon DNA oxidation cause moderate inhibition of DNA synthesis, which is DNA polymerase and sequence dependent. Fapy-7MeG, a methylated counterpart of FapyG-, a efficiently inhibits DNA replication in vitro and in E.coli, however its mutagenic potency is low. This is probably due to preferential incorporation of cytosine opposite Fapy-7MeG and preferential extension of Fapy-7MeG:C pair. In contrast, FapyA and Fapy-7MeA possess miscoding potential. Both lesions in SOS induced E.coli preferentially mispair with cytosine giving rise to A$\rightarrow$G transitions. Fapy lesions substituted with longer chain alkyl groups also show simult aneous lethal and mutagenic properties. Fapy lesions are actively eliminated from DNA by repair glycosylases specific for oxidized purines and pyrimidines both in bacteria and eukaryotic cells. Bacterial enzymes include E.coli formamidopyrimidine-DNA-glycosylase (Fpg protein), endonuclease III (Nth protein) and endonuclease VIII (Nei protein).

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제16권1호
• /
• pp.20-24
• /
• 2006

Plasmid DNA (pDNA) is a product of interest for many biopharmaceutical companies and research laboratories, because of increase in the number of gene therapy protocols that use nonviral vectors. This work was undertaken to study the effect of antibiotic and dissolved oxygen concentration (DOC) on the production of a ColE 1-type plasmid (pVAX1-LacZ) hosted in Escherichia coli $DH5\alpha$ and cultured in a batch fermentor with 0.751 of Terrific Broth. A decrease in the DOC from $60\%\;to\;5\%$ was shown to increase the specific pDNA concentration approximately 1.5-fold, due to the downregulation of growth. Additionally, this increase in the pDNA concentration led to a 2.2-fold increase in the purity of cell lysates obtained after cell lysis. However, the use of higher DOC led to 2.8-fold higher volumetric productivity as a consequence of a faster growth rate, reducing the fermentation time from 24 to 8 h. Interestingly, the specific pDNA concentration, and pDNA productivity and purity were always higher $(10-15\%)$ in the absence of antibiotic. Overall, the data indicate that nonselective conditions can be used without compromising yield, productivity, and purity of pDNA.

• 환경생물
• /
• 제29권3호
• /
• pp.236-240
• /
• 2011

수은이 DNA 수복에 미치는 영향을 알아보기 위해 E. fetida를 염화수은(II)과 이온화 방사선에 순차적으로 노출시킨 후, 단세포 겔 전기영동 기법을 이용하여 DNA의 손상 수준과 방사선 조사 후 시간 경과에 따른 수복 양상을 관찰하였다. 염화수은(II)의 농도를 40 mg $kg^{-1}$으로 하여 48시간 동안 in vivo 노출 시험을 수행한 뒤 20Gy의 감마선을 조사한 결과, 시간이 지날수록 대체로 DNA 손상의 수준이 감소했다. 이온화 방사선에 의해 손상된 DNA가 완전히 수복되기 위해 요구되는 시간을 비교해 보면, 수은과 감마선에 함께 노출된 E. fetida는 방사선 조사 후 약 37시간, 감마선만 조사한 실험군은 약 2.35시간이 지나고 난 뒤 손상된 DNA의 대부분이 수복되는 것을 볼 수 있었다. 한편 E. fetida에 20 Gy의 감마선을 조사하면 방사선 조사가 끝나고 약 45분, 수은 처리 후 방사선을 조사하면 약 1시간 12분 정도가 경과한 시점에서 손상되었던 DNA의 절반이 수복되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 DNA 수복 속도가 빠른 구간을 도식화하여 그 기울기를 계산한 결과, 수은에 노출된 실험군의 DNA 수복률은 수은에 노출되지 않은 실험군보다 약 5배 정도 수복 속도가 느리다고 판단할 수 있었다. 손상된 DNA가 천천히 수복되는 구간을 수식으로 표현해 DNA의 미수복분율을 산출하면 방사선 단독처리군과 수은 및 방사선의 복합처리군의 미수복분율은 각각 0.4910과 0.9470로 나타난다. 미수복분율 값의 차는 수은에 의해 DNA의 정상적인 수복이 방해되었음을 의미한다.

• IMMUNE NETWORK
• /
• 제11권5호
• /
• pp.268-280
• /
• 2011

Background: Dengue virus, which belongs to the Flavivirus genus of the Flaviviridae family, causes fatal dengue hemorrhagic fever (DHF) and dengue shock syndrome (DSS) with infection risk of 2.5 billion people worldwide. However, approved vaccines are still not available. Here, we explored the immune responses induced by alternating prime-boost vaccination using DNA vaccine, adenovirus, and vaccinia virus expressing E protein of dengue virus type 2 (DenV2). Methods: Following immunization with DNA vaccine (pDE), adenovirus (rAd-E), and/or vaccinia virus (VV-E) expressing E protein, E protein-specific IgG and its isotypes were determined by conventional ELISA. Intracellular CD154 and cytokine staining was used for enumerating CD4+ T cells specific for E protein. E protein-specific CD8+ T cell responses were evaluated by in vivo CTL killing activity and intracellular IFN-${\gamma}$ staining. Results: Among three constructs, VV-E induced the most potent IgG responses, Th1-type cytokine production by stimulated CD4+ T cells, and the CD8+ T cell response. Furthermore, when the three constructs were used for alternating prime-boost vaccination, the results revealed a different pattern of CD4+ and CD8+ T cell responses. i) Priming with VV-E induced higher E-specific IgG level but it was decreased rapidly. ii) Strong CD8+ T cell responses specific for E protein were induced when VV-E was used for the priming step, and such CD8+ T cell responses were significantly boosted with pDE. iii) Priming with rAd-E induced stronger CD4+ T cell responses which subsequently boosted with pDE to a greater extent than VV-E and rAd-E. Conclusion: These results indicate that priming with live viral vector vaccines could induce different patterns of E protein-specific CD4+ and CD8+ T cell responses which were significantly enhanced by booster vaccination with the DNA vaccine. Therefore, our observation will provide valuable information for the establishment of optimal prime-boost vaccination against DenV.

• 환경생물
• /
• 제41권4호
• /
• pp.637-656
• /
• 2023

강 하구는 높은 생산성을 나타내는 생물다양성이 가장 높은 대표 수생태계이다. 환경 DNA (eDNA)를 이용한 수생태계 모니터링은 현장의 환경 시료를 확보하여 시료 내 존재하는 생물로부터 유래된 DNA를 추출하는 방법으로서 기존의 어구를 이용한 현장조사 모니터링에 비해 효율적이고 민감도가 높아 보완적인 방법으로 이용되고 있다. 본 연구는 낙동강 수계 하구 생태계를 대표하는 내륙 습지 하천인 태화강과 창원천을 대상으로 환경특성, 어류 군집구조와 종 다양성을 파악하였다. 태화강에서는 양측회유성, 소하성 및 강하성 어류인 은어, 황어 및 뱀장어의 서식이 대부분의 조사 시기 동안 확인되어 연안에서부터 중류 및 지류까지 비교적 원활한 서식처 종적 연결성을 나타내는 생태계임을 알 수 있었다. 또한, 창원천의 경우 특히 바다와 가까운 내륙 습지 하천으로 많은 다양한 해산어류 및 망둑어류의 서식이 확인되었으나, 회유성 어종인 은어는 환경 DNA에서만 검출되었고 현장조사에서는 관찰되지 않았다. 어구조사를 통한 종 다양성 평가 결과 태화강이 창원천에 비해 낮은 우점도지수, 높은 풍부도, 균등도, 다양도지수 수치를 나타내어 상대적으로 양호한 어류 군집 구조 상태를 나타냈다. 어구를 이용한 현장조사와 환경 DNA 메타바코딩 기법을 이용하여 태화강과 창원천 하구 생태계 어류 군집 구조 및 종 다양성을 비교 분석하였다. 어구를 이용한 3회 현장조사 결과 9~19종이 확인되었고 환경 DNA 1회 분석 결과 11~18종으로 환경 DNA 분석이 현장조사 결과와 유사한 수준의 종 수를 확인할 수 있었다. 어구를 이용한 5월 현장조사 결과는 6~11종이 확인된 점을 고려하면 환경 DNA가 종 탐지에서 민감도가 더 높음을 알 수 있었다. 환경 DNA를 이용한 수생태계 모니터링을 위한 어류 종 탐지의 잠재적인 효용성을 확인할 수 있었으나 우리나라 고유종 및 유전적으로 가까운 근연종들의 경우 명확한 종 동정에 어려움이 있었으며, 현장조사 시 관찰되었으나 환경 DNA에서 검출되지 않은 경우(위음성; false negative)와 현장조사 시 관찰되지 않은 종이 환경 DNA에서 검출(위양성; false positive)되는 자료의 한계점도 존재하였다. 향후 국내 고유종의 local DB 확보, 환경 DNA 조사 표준화 방법 구축, 국내 담수어류 대상 분자마커 개발 등이 확립된다면 수생태계 모니터링에 아주 효율적이며 실용적인 조사 방법으로 적용될 수 있을 것으로 판단된다.