• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제19권3호
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• pp.271-276
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• 2009

Functional gene studies in the cultivated white button mushroom Agaricus bisporus have been constrained by the absence of effective gene-silencing tools. Using two endogenous genes from A. bisporus, we have tested the utility of dsRNA hairpin constructs to mediate downregulation of specific genes. Hairpin constructs for genes encoding orotidine 5'-monophosphate decarboxylase (URA3) and carboxin resistance (CBX) were introduced into A. bisporus using Agrobacteriummediated transfection. Although predicted changes in phenotype were not observed in vitro, quantitative-PCR analyses indicated unambiguously that transcripts in several transformants were substantially reduced compared with the non-transformed controls. Interestingly, some hairpin transformants exhibited increased transcription of target genes. Our observations show that hairpin transgenic sequences can mediate downregulation of A. bisporus endogenous genes and that the technology has the potential to expedite functional genomics of the mushroom.

• 생명과학회지
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• 제19권3호
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• pp.317-321
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• 2009

다운증후군은 추가적으로 존재하는 인간염색체 21번에 위치한 유전자의 과발현으로 발병한다. 다운증후군 환자에서 보이는 여러 증상들 중 학습과 기억능력 저하와 같은 뇌기능 저하는 다운증후군 환자가 독립적인 생활을 영위하는데 가장 큰 걸림돌이 된다. 인간염색체 21번에 위치하는 Dyrk1A는 신경발달에 중요한 역할을 하는 단백질로 Dyrk1A를 과발현 하는 형질전환 생쥐에서 심각한 해마 의존적 학습과 기억 장애가 보고되었다. 본 연구에서는 인간 Dyrk1A를 과발현 하는 형질전환 생쥐와 RNA interference (RNAi) 방법을 이용하여 endogenous mouse Dyrk1A의 발현은 정상적으로 유지하면서 exogenous human Dyrk1A 발현은 특이적으로 저해함으로써 인간 Dyrk1A 과발현에 의한 학습과 기억 능력저하를 회복시킬 수 있는지 동물모델에서 검증하기 위한 첫 단계로 인간 Dyrk1A 특이적 lentiviral short hairpin RNA (shRNA)를 발굴하였다. 발굴된 shRNA를 이용한 형질전환 모델생쥐에서의 증상의 회복 가능성 검증은 다운증후군의 뇌기능저하 치료제 개발에 중요한 정보를 제공할 것이다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제30권3호
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• pp.181-187
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• 2006

최근 돼지의 장기를 사람에게 이식하는 이종간 장기 이식에 관한 연구가 급속히 발전되고 있다. 그러나 돼지의 장기를 이식할 경우 가장 큰 문제점 중의 하나는 돼지 genome 내에 존재하는 내인성 레트로바이러스(porcine endogenous retrovirus; PERV)가 인간에게 그대로 전이될 수 있다는 것이다. 이에 대한 대안으로 최근 활발히 연구되고 있는 RNA 간섭을 통한 PERV RNA의 발현을 최대한 억제하는 방법이 제안되고 있는데, RNA 간섭(RNA interference)은 double-standard RNA(dsRNA)가 상보적인 표적 mRNA를 분해하여 결과적으로 표적 단백질의 발현을 특이적으로 억제하는 현상을 의미한다. 본 연구에서는 PERV에 대한 RNA 간섭 현상을 일으키는 shRNA 유전자를 레트로바이러스 벡터를 이용하여 돼지세포에 RNA)가 상보적인 표적 mRNA를 분해하여 결과적으로 표적 단백질의 발현을 특이적으로 억제하는 현상을 의미하다. 도입한 후 PERV의 발현율 감소 여부를 조사하였다. 그 결과, gag-pol 유전자와 env 유전자 발현은 각각 대조군 세포의 4%와 10% 정도로 억제되었다. 한편, virus 입자의 생산에서 gag-pol 유전자는 대조군 세포에 비해 300배 이상 억제되었으며, env 유전자에서는 20만 배 이상 억제되었다. 이상의 결과를 미루어 볼 때 형질 전환 돼지를 이용한 이종 장기 이식에 있어서 RNA 간섭 현상을 이용한 PERV의 발현을 억제하는 시도는 생물학적안전성을 크게 증가시킬 수 있을 것으로 사료된다.

• 한국동물학회지
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• 제27권2호
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• pp.103-116
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• 1984

유전자 구조 및 유전정보 흐름의 차이로 인하여 고등생물의 유전자를 미생물에 직접 cloning하면 원하는 유전자 산물을 얻지 못하는 경우가 많다. 이것을 극복하기 위해서는 화학적인 방법으로 유전자를 합성하든지, 또는 역제효소를 사용하여 고등생물의 mRNA로부터 유전자를 합성하여 cloning하는 방법을 사용한다. 본 연구에서는 oligo(dT)-cellulose column 방법으로 순수분리한 plasmid pBR322의 Pst I site에 cloning하였다. 우선 AMV reverse transcriptase로 primary cDNA를 합성하고, 알칼리를 처리하여 주형 RNA를 제거했다. 이번에는 이 primary cDNA를 주형으로 Klenow enzyme과 reverse transcriptase를 차례로 처리하여 double stranded DNA를 합성하고, 이 때 5' end 근처에 형성되는 hairpin loop을 Sl nuclease로 제거했다. Terminal deoxynucleotidyl transferase를 사용하여, 합성된 dsDNA에는 poly(dC) track을, Pst I endonuclease를 처리한 plasmid DNA에서는 poly(dG) track을 각각 붙인다음 이들을 서로 annealing시키고 E. coli에 transformation시켜서 크기가 큰 plasmid를 갖는 clone을 cracking 방법으로 일처 선별하였다. 이렇게 선별된 clone을 in 냐셔 hybridization 방법으로 조사하여 globin DNA가 들어간 colony를 이차 선별하고 여러 restriction enzyme으로 잘라보아 globin DNA가 cloning된 것을 확인하였다. 토끼 hemoglobin으로 immunize한 rat (Wistar)에서 뽑은 제일차 혈청과 염소에서 뽑은 제이차 혈청의 antibody를 사용한 radioimmunoassay방법으로, cloning된 globin gene이 대장균내에서 발현되는 지의 여부를 살펴 보았는데, 박테리아의 $\\beta$-lactamase와 토끼의 globin이 결합된 chimeric protein이 대장균 내에서 다량 합성되며, 이 단백질은 토끼 hemoglobin의 antigenic determinant를 가지고 있음을 알 수 있었다.