• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제20권3호
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• pp.334-339
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• 2007

Reactive oxygen species (ROS) generate during electrical activation of oocytes which has detrimental effects on embryo survival when overwhelmed. The present study was designed to investigate the ability of L-ascorbic acid, a novel water soluble antioxidant, to reduce the ROS level in developing embryos and their subsequent effects on embryo development in vitro. The compact cumulus oocyte complexes (COCs) were cultured in tissue culture medium (TCM)-199 supplemented with 10 ng/ml epidermal growth factor, 4 IU/ml pregnant mare serum gonadotropin (PMSG), and human chorionic gonadotropin (hCG) and 10% (v/v) porcine follicular fluid (pFF) for 44 h. After maturation culture, the denuded oocytes were activated with a single DC pulse of 2.0 kV/cm in 0.3 M mannitol solution containing 0.5 mM of HEPES, 0.1 mM of $CaCl_2$ and 0.1 mM of $MgCl_2$ for $30{\mu}s$ using a BTX Electro-cell Manipulator. The activated oocytes were cultured in modified North Carolina State University-23 (mNSCU-23) medium for 168 h. The level of $H_2O_2$ in each embryo was measured by the dichlorohydrofluorescein diacetate (DCHFDA) method at 48 h after activation. The blastocyst formation rate was significantly higher when culture medium was supplemented with 50 and $100{\mu}M$ L-ascorbic acid (31.2 and 38.7%, respectively) compared to non-supplemented (16.1%) group. Accordingly, significantly more cells in blastocyst were found for 50 and $100{\mu}M$ L-ascorbic acid (50.0 and 56.4, respectively) compared to 0 and $200{\mu}M$ L-ascorbic acid (36.5 and 39.8, respectively). L-ascorbic acid reduces the $H_2O_2$ level in developing embryos in a dose-dependant manner. The $H_2O_2$ level (pixels/ embryos) was 191.5, 141.0, 124.0 and 163.3 for 0, 50, 100 and $200{\mu}M$ L-ascorbic acid, respectively. So, we recommend to supplement 50 or $100{\mu}M$ L-ascorbic acid in porcine in vitro culture medium.

• 한국수정란이식학회지
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• 제22권4호
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• pp.245-249
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• 2007

The aim of present experiment was to examine hatching rate as in vitro indicator of viability of porcine embryos before early stage embryo transfer such as zygotes or 2-cell stage embryos. Cumulus-oocyte complexes (COCs) collected from ovaries were matured in North Carolina State University 23 (NCSU-23) containing 10% porcine follicular fluid (pFF), 10 ng/ml epidermal growth factor (EGF), $10{\mu}g/ml$ follicle stimulating hormone (FSH), $35{\mu}g/ml$ luteinizing hormone (LH), and 1mg/ml cysteine. After 24 hours, the COCs were transferred to the same medium without hormones. After 65h of maturation, oocytes were exposed to phosphate buffered saline (PBS) with 7% ethanol (v/v) for 7 minutes, and then the oocytes were washed and cultured in tissue culture medium (TCM) 199 containing 5 ug/ml cytochalasin B for 5h at $38.5^{\circ}C$ in an atmosphere of 5% $CO_2$ and 95% air with high humidity. After cytochalasin B treatment, the presumptive parthenotes were cultured in porcine zygote medium (PZM)-5 and cleavage of the parthenotes was assessed at 72h of activation, Normally cleaved parthenotes were cultured for an additional 8 days to evaluate their ability to develop to blastocyst and hatching stages. The fetal bovine serum (FBS) were added at Day 4 or 5 with concentrations of 2.5, 5 or 10%. The blastocyst rates were ranged within $39.1{\sim}70%$ in each treatment. However hatching rate was dramatically decreased in non-addition group. In this experiment, embryo viability in female reproductive tract may be estimated before embryo transfer with in vitro culture adding FBS by hatching ability.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제28권2호
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• pp.95-103
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• 2001

연구목적: 본 연구는 생쥐 preantral follicles의 체외 배양 조건을 확립하고 이를 기초로 높은 체외 발달률 그리고 산자 생산률을 얻고자 하였다. 연구재료 및 방법 : Preantral follicles의 oocyte-granulosa cell complexes (OGCs)는 생후 12일된 FI ($C57BL{\times}CBA$)으로부터 난소를 적출하여 효소를 이용한 방법을 통해 획득하였다. 회수된 complexes는 10일 또는 12일 동안 체외 성장을 위해 Transwell-COL membrane insert로 옮겨졌고 5% FBS, 100 mIU/ml FSH, 100 mIU/ml hMC가 첨가된 ${\alpha}MEM$에서 배양되었다. 체외 성숙을 위해 1.5 IU/ml hCG가 첨가된 ${\alpha}MEM$에서 18 hrs 배양을 실시하였다. 그 후 M16에서 수정능력이 획득된 정자와 수정을 하여 4 hrs, 7 hts, 9 hrs 후에 10% FBS가 첨가된 modified M16 배양액에서 4일간 배양하거나 또는 bovine cumulus cell과 co-culture를 실시하였다. 그리고 형태적으로 정상적인 22개의 상실배와 포배를 2마리의 위임신 대리모 (ICR)의 자궁에 이식하여 산자 생산을 유도하였다. 결과: 1) OGCs 크기가 mouse preantral follicles의 핵 및 세포질 성숙에 미치는 영향을 조사하였을 때 $120{\sim}150{\mu}m$의 preantral follicles (MII: 33.0%, 난할률: 36.7%, 상실배 이상; 20.9%)은 핵 및 세포질 성숙에 있어서 $70{\sim}110{\mu}m$ (MII: 12.2%, 난할률: 10.2%, 상실배 이상: 4.8%)보다 더 높았다(p<0.001). 2)체외 성장기간의 연장이 mouse preantral follicles의 핵 및 세포질 성숙에 미치는 영향을 조사하였을 때 10일 (난할률: 38.2%)은 12일 (난할률: 20.0%)보다 난할률에서만 더 높았다 (p<0.01). 3) 체외 수정 시간의 연장이 mouse preantral follicle의 세포질 성숙에 미치는 영향을 조사하였을 때 9 hrs (난할룰 31.5%, 상실배 이상: 14.3%)은 4 hrs (난할률: 17.5%, 상실배 이상: 4.8%), 7 hrs (난할률: 20.4%, 상실배 이상: 6.1%) 보다 세포질성숙에 있어서 유의하게 높은 발달률을 나타냈다 (p<0.01). 4) 공배양이 mouse preantral follicle의 세포질성숙에 미치는 영향을 조사하였을 때 공배양 (상실배 이상: 17.4%)을 실시했을 때와 M16 (상실배 이상17.4%)에서 배양되었을 때는 차이가 없었다. 5)preantral follicle의 크기 ($120{\sim}150{\mu}m$), 체외 성장기간 (10일), 체외 수정 기간 (9시간), 배양 환경 (단지 medium만 존재)의 적절한 결과들을 종합하여 수행하였을 때 MII 성숙률, 난할률, 상실배 이상의 발달률은 30.2%, 39.3%, 22.5%이었고 총 22개의 상실배 및 포배를 2마리의 대리모에 이식했을 때 1마리가 임신했고 1마리의 산자를 생산했다. 결론: 따라서, 본 실험은 preantral follicle을 이용한 체외 배양 시스템이 생쥐 oocyte를 공급하는 또 다른 방법으로 효과적으로 이용될 수 있다는 것을 시사한다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제19권2호
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• pp.173-183
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• 2004

본 연구는 pFF, cysteine, ${\beta}$-mercaptoethanol, 성선자극호르몬 등 여러 가지 체외성숙 촉진 물질이 첨가딘 성숙배양액에 EGF 첨가가 돼지 미성숙 난포란의 체외성숙에 효과적인지 또한 그 효가는 배양소적당 COC의 수에 영향을 받는지을 구명하고자 EGF의 첨가 유무와 배양소적당 COC수(50개 또는 15개)를 조합한 $2{\times}2$ 요인시험을 실시했다. 도축돼지의 난소에서 채취한 COCs를 각 처리별로 mNCSU-23 에서 성숙배양하고 mTBM에서 운동정자의 최종동도가 $1{\times}10^5$sperm/mL 의 농도로 체외수정한 다음 NCSU-23 에서 체외발달을 유도한 결과는 다음과 같다. 1. 대조구와 EGF 첨가구에서 C4군의 COC 비율이 각각 41%dhk 82%로써 EGF 첨가가 난구세포의 팽화 정도를 크게 향상시키는 것으로 나타났으나, 난핵포 붕괴율과 핵성숙율에서는 EGF 첨가 여부나 배양소적당 COC 수에 따른 차이가 나타나지 않았고 두 요인간 상호작용도 없었다. 2. 정자 침투율, 웅성전핵 형성율 및 다정자수정 발생율에서도 EGF 첨가 여부나 배양소적당 COC 수에 따른 차이가 유의적인 것이 아니었고, 두 요인간 상호작용 역시 유의적이지 않았다. 3. 난분할율에서는 처리간에 유의적인 차이가 나타나지 않았으나 배반포 발달율, 배반포의 ICM 세포수, TE 세포수 및 총세포수에서는 EGF 첨가구가 모두 유의적으로 높았다(p<0.01). COC수에 따른 차이나 두 요인간 상호작용에서는 유의성이 인정되지 않았다. 결과적으로 돼지 미성숙 난포란을 mNCSU-23에서 성숙배양할 때 10 ng/mL EGF 첨가는 성숙배양 단계에서 난구세포의 팽화를 더욱 심화시키고, 발달배양단계에서 배반포의 세포수와 배반포발달율을 증가시키는데 효과가 있는 것으로 사료된다.

• Journal of Animal Science and Technology
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• 제48권6호
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• pp.797-804
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• 2006

본 연구에서는 동결 보호제 EG l에 sucrose 첨가 농도에 따른 생존성의 실험의 결과를 요약하면 다음과 같다. 1.5 M EG와 1.8 M EG 만을 이용하여 동결융해 후 생존서의 조사한 결과 71.1%와 70.2%로 각각 나타났다. 총세포수에 있어서도 127±1.3개와 124±1.6개로 생존율과 총세포수에 있어서도 두 그룹간에는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 1.5 M EG와 1.8 M EG에 0.1 M sucrose를 각각 첨가한 후 동결 보존하여 융해 하였을 때 생존율과 총세포수 조사 결과는 1.5 M EG에 0.1 M sucrose 처리구가 73.6% 그리고 1.8 M EG 에 0.1 M sucrose 첨가군은 76.9%의 결과를 보였으며 총세포수 에 있어서도 118±1.2 와 112±1.2 개의 결과를 보여 생존성과 총세포수에 있어서도 두 처리군 모두 유의적인 차이를 나타내지 않았으나 1.5 M EG 처리구에서 총세포수는 다소 높은 경향을 보였다. 1.5 M EG 와 1.8 M EG에 0.3 M sucrose를 첨가하여 각각 생존성과 총세포수 조사 결과는 70.8%와 88.7%의 생존율을 나타내어 1.8 M EG 에 0.3 M sucrose 처리구가 유의적으로(P<0.05) 높은 결과를 보였다. 따라서 소 체외수정란을 conventional slow-freezing 방법으로 동결 보존할 경우는 1.8 M EG 동결보호제에 0.3 M sucrose를 병행하여 사용하는 방법이 수정란을 최상의 상태로 유지할 수가 있어 수정란이식에 적용할 경우 효과적일 것으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제22권3호
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• pp.293-300
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• 1998

본 연구는 체외에서 성숙되고 수정된 소 수정란의 체외 발달에 thiol compound인 $\beta$-mercaptoethanol($\beta$-ME)과 cysteine(CYS)의 첨가 효과를 알아보기 위하여 실시하였다. 미성숙 난포란을 회수한 후 TCM-199 배양액내에서 24시간 동안 성숙을 유도하였다. 수정은 Fert-TALP 배양액에서 실시하였으며, 2세포기로 발달한 수정란만을 선별하여 CR1aa 배양액내에 $\beta$-ME 및 CYS를 첨가하여 체외배양하였다. 실험 1에서는 $\beta$-ME과 CYS의 최적농도를 알아보기 위해서 0, 5, 25, 125$\mu$M의 $\beta$-ME과 0, 0.01, 0.1, 0mM의 CYS이 첨가된 배양액에 2세포기 난자를 9일 동안 배양하면서 배반포까지 발달율을 조사하였다. 그 결과 25$\mu$M의 $\beta$-ME 그리고 0.1mM의 CYS이 첨가된 배양액에서 배반포까지의 발달율은 각각 30.7%와 31.0%로 대조군의 발달율(8.0%, 15%)에 비해 유의적으로 높은 결과를 보였다(P<0.05). 실험 2에서는 배반포 형성에 있어 최적농도인 25$\mu$M의 $\beta$-ME과 0.1mM의 CYS을 각각 초기배(2$\longrightarrow$8세포기)와 후기배 (8세포기 이후) 배양시 첨가하였을 때, 그 효과를 알아보았다. 그 결과 후기배양시 25$\mu$M의 $\beta$-ME과 0.1mM의 CYS이 첨가된 배양액내에서 배반포까지의 발달율은 각각 60.2%와 43.1%로 초기배 배양에서의 첨가군(18.2%, 23.7%)과 대조군(22.5%, 18.1%)에 비해 유\ulcorner거으로 높게 나타났다(P<0.05). 따라서 배양액내 $\beta$-ME과 CYS의 첨가는 체외에서 생산된 소 난자의 배발달율을 향상시키며, 초기배 수정란의 genome 활성이 일어나는 시기 (8~16 세포) 이후에 첨가효과가 큼을 알 수 있었다.

• 한국가축번식학회지
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• 제22권4호
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• pp.425-435
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• 1998

본 연구는 핵이식 효율을 증진시키기 위하여 소의 핵이식에 있어서 MII 의 탈핵난자의 활성화 방법과 공핵란으로써 개별배양과 그룹배양된 수정란을 사용하여 할구분리시 발견할수 있는 할구의 크기별로 대ㆍ소로 구분하여 핵이식에 미치는 영향을 비교하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 핵이식에 있어 MII의 탈핵난자에 5$\mu$M ionomycin 에서 5분 처리후 2.0 mM DMAP 을 4시간동안 처리구, 탈핵 후 체외성축으로부터 39~43시간에 2.0 mM DMAP 올 4시간동안 처리구와 탈핵후 체외성숙으로부터 39~42시간에 실온에 3시간 두어 활성을 유도한 처리구에서 융합율은 각각 68, 74.7와 72.8%를 보여 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 배반포기배로의 발달율에 있어서도 10.0, 14.3와 9.0%로써 처리구간의 유의적인 차이는 보이지 않았다. 하지만 핵이식 후 7일째 배반포기 배로 발달한 수정란의 할구수에서는 각 처리구 별로 79.2개, 73.4개 그리고 53.2개로 체외성숙으로부터 39~42시간에 실용에 3시간 두어 활성화를 유도한 처리구가 다른 처리구에 비하여 유의적으로 낮게 나타났다 (P＜0.05). 2. 수정후 90시간 개별 배양 또는 그룹배양된 수정란의 평균할구수는 11.1 개로 같게 나타났으며 할구분리시 할구의 크기는 평균 46.8, 46.6$\mu\textrm{m}$로 나타났으며, 두 그룹 모두 46$\mu\textrm{m}$를 기준으로 large 와 small 로 나누었을 때 개별배양에서는 할구의 크기가 42.0, 50.9$\mu\textrm{m}$로 측정되었으며, 그룹배양에서는 41.6, 50.6$\mu\textrm{m}$로 측정되었다. 수정후 114시간 개별 및 그룹배양된 수정란의 평균할구수는 16.8개와 17.6개로 나타났으며, 할구분리시 할구의 크기는 평균 39.3, 38.7$\mu\textrm{m}$로 나타났다. 두 그룹 모두 38$\mu\textrm{m}$ 를 기준으로 Large 와 small로 나누었을 때 개별배양에서는 할구의 크기가 42.5, 35.2$\mu\textrm{m}$로 측정되었으며, 그룹배양에서는 42.1, 34.8$\mu\textrm{m}$ 로 측정되었다. 3. 핵이식 수정란의 세포융합율에 있어서 수정 후 90시간 개별배양된 수정란의 small 과 large 의 할구를 공핵체로 사용한 처리구에서 69.2 와 72.3%, 그룹배양된 수정란의 small 과 large의 할구를 공핵체로 사용한 처리구에서는 71.6와 76.3%의 융합율을 보여 유의적으로 차이를 나타내지 않았으며, 핵이식 수정란의 배반포기배로의 발달율에 있어서도 각 각 11.1, 10.2, 12.2 그리고 13.0%의 발달율을 보여 유의적인 차이를 보이지 않았다. 4. 수정 후 114 시간 개별배양된 수정란으로부터 분리된 small과 large의 할구를 공핵체로 사용한 처리구에서 핵이식 수정란의 세포융합율에 있어서 각각 71.0, 71.4, 69.9 및 77.1% 의 융합율올 보여 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 핵이식 수정란의 배반포기배로의 발달율에 있어서도 각각 11.4%, 8.0%, 17.2% 그리고 12.9% 의 발달율을 보여 유의적인 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과로 보아 핵이식 수정란을 효율적으로 생산하기 위하여 수핵난자의 세포질에 ionomycin 과 DMAP 의 혼합처리로 탈핵난자의 활성화를 유도하는 것이 효율을 증진시킬 수 있었다고 본다. 또한 공핵수정란을 수정 후 90시간과 114시간 개별 배양하여 할구를 공핵체로 핵이식에 이용하였을 때도 그룹배양에 비하여 효율이 떨어지지 않음을 알 수 있었으며, 수정란의 할구 크기의 차이가 핵이식 수정란의 생산효율에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.

• 한국가축번식학회지
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• 제24권4호
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• pp.395-406
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• 2000

본 연구는 다양한 농도의 FSH 와 LH 에서 배양된 생쥐 preantral follicles 내 난자의 발생능력을 조사하고, 이러한 조건에서 배양된 난자 -난구세포 복합체에서 황체화의 지표인 cytochrome P450 cholesterol side-chain cleavage enzyme (P450scc)와 퇴행화의 지표인 cytochrome P450 17 $\alpha$ -hydroxylase (P450$_{17{\alpha}}$ ) mRNA의 발현정도를 조사하고, 또한 progesterone과 testosterone의 분비농도를 살펴보기 위하여 실시하였다. 체외성장된 난자의 배반포까지의 발달능력은 100 $m\ell$U/$m\ell$ FSH 단독첨가군 (30.2%)과 100 $m\ell$U/$m\ell$ FSH$\pm$l0$m\ell$U/$m\ell$ LH 첨가군 (28.0%)이 100$m\ell$U/$m\ell$ FSH＋100$m\ell$U/$m\ell$ LH 첨가군 (22.0%) 보다 높은 결과를 나타냈다. 그리고 배반포의 평균 세포수에 있어서도 FSH 단독첨가군 (50.9$\pm$26.1)과 100$m\ell$U/$m\ell$ FSH＋10 $m\ell$U/$m\ell$LH 첨가군 (51.0$\pm$26.1)이 100$m\ell$U/$m\ell$ FSH＋100$m\ell$U/$m\ell$ LH 첨가군 (45.2$\pm$15.1) 보다 많은 것으로 조사되었다. 난자 -난구세포 복합체에서 P450scc 와 P450$_{17{\alpha}}$의 발현은 LH의 첨가농도가 증가함에 따라서 증가하였으며, 그리고 progesterone과 testosterone의 분비도 증가를 하였다. 특히, P450scc 와 P450$_{17{\alpha}}$ 의 발현 그리고 progesterone과 testosterone의 분비는 100$m\ell$U/$m\ell$ FSH＋100$m\ell$U/$m\ell$ LH 첨가군에서 다른 첨가군들에 비하여 유의하게 증가하였다. 따라서, 이러한 결과들은 성선자극호르몬이 preantral follicles의 체외배양을 위해서는 필수적이지만, LH 첨가농도의 증가는 난자의 발생능력을 감소시킨다는 것을 보여주었다. 그리고 이러한 결과에 대한 원인의 하나는 황체화의 지표인 P450scc와 퇴행화의 지표인 P450$_{17{\alpha}}$ 발현의 증가에 의한 progesterone과 testosterone의 분비증가에 기인한 것으로 추정된다. 결론적으로, 본 연구는 배양액내에 100$m\ell$U/$m\ell$ FSH 혹은 100$m\ell$U/$m\ell$ FSH+10 $m\ell$U/$m\ell$ LH 의 첨가가 생쥐 preantral follicles의 체외배양을 위한 적정조건임을 제시하고 있다.