Abstract
To improve the efficiency of nuclear transplantation in bovine, in this study the development in vitro of nuclear transferred (NT) embryos was compared by different activation regimens of the enucleated oocytes. The effect of developmental stage and culture system of donor nuclei on fusion and development in vitro of NT embryos were also evaluated. Oocytes were collected from Hanwoo ovaries obtained from slaughterhouse and matured in Ham's F-10 supplemented with hormones. After 20~22 h maturation, the oocytes were vortexed to be free from cumulus cells and subsequently their nucleus and the first polar body were removed. Enucleated oocytes were divided into 3 groups for activation; the oocytes of group I were activated with ionomycin for 5 min and subsequently incubated in 6-dimetylarninopurine (DMAP) for 4 h, Those of group II were treated with DMAP for 4 h at 39 h after onset of in vitro maturation (IVM) and those of group III were kept in room temperature ($25^{\circ}C$) for 3 h at 39 h after onset of IVM. After in vitro fertilization (IVF) the embryos for muclear donor were cultured either by group culture (20 embryos /50 ${mu}ell$ drop) or individually (1 embryo /50 ${mu}ell$ drop) for 4 day and 5 day. At day 4 and 5 after IVF, blastomeres were separated in calcium-magnesium free medium, and then classified into small (day 5: $\leq$ 38 ${\mu}{\textrm}{m}$, day 4: $\leq$ 46 ${\mu}{\textrm}{m}$) and large (day 5 : $\geq$ 38 ${\mu}{\textrm}{m}$, day 4 ; $\geq$ 46 ${\mu}{\textrm}{m}$). The separated blastomeres were replaced into enucleated and activated recipient cytoplasm. The blastomere-oocyte complexes were fused by electrically. The NT embryos were cultured in TCM-199 containing 10% FCS in 39$^{\circ}C$, 5% $CO_2$ incubator for 7 day. The results obtained were summarized as follows; There were no differences in fusion and development to blastocyst between groups as group I (68%, 10%), group II (75%, 14%) and group III (73%, 9%), respectively. However, the cell number in blastocyst of NT embryos in group III were significantly fewer than in the other groups (P＜0.05). No differences in fusion and development to blastocyst were found between individual or group cultured and between small or large blastomeres of day 4 and day 5 donor embryos. From these results, it was concluded that the combination of ionomycin and DMAP, or treatment of DMAP at 39 h after onset of IVM were useful for the efficient of production of NT bovine embryos, and the individual cultured embryos could be simply used as donor nuclei for NT bovine embryo.
본 연구는 핵이식 효율을 증진시키기 위하여 소의 핵이식에 있어서 MII 의 탈핵난자의 활성화 방법과 공핵란으로써 개별배양과 그룹배양된 수정란을 사용하여 할구분리시 발견할수 있는 할구의 크기별로 대ㆍ소로 구분하여 핵이식에 미치는 영향을 비교하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. 핵이식에 있어 MII의 탈핵난자에 5$\mu$M ionomycin 에서 5분 처리후 2.0 mM DMAP 을 4시간동안 처리구, 탈핵 후 체외성축으로부터 39~43시간에 2.0 mM DMAP 올 4시간동안 처리구와 탈핵후 체외성숙으로부터 39~42시간에 실온에 3시간 두어 활성을 유도한 처리구에서 융합율은 각각 68, 74.7와 72.8%를 보여 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 배반포기배로의 발달율에 있어서도 10.0, 14.3와 9.0%로써 처리구간의 유의적인 차이는 보이지 않았다. 하지만 핵이식 후 7일째 배반포기 배로 발달한 수정란의 할구수에서는 각 처리구 별로 79.2개, 73.4개 그리고 53.2개로 체외성숙으로부터 39~42시간에 실용에 3시간 두어 활성화를 유도한 처리구가 다른 처리구에 비하여 유의적으로 낮게 나타났다 (P＜0.05). 2. 수정후 90시간 개별 배양 또는 그룹배양된 수정란의 평균할구수는 11.1 개로 같게 나타났으며 할구분리시 할구의 크기는 평균 46.8, 46.6$\mu\textrm{m}$로 나타났으며, 두 그룹 모두 46$\mu\textrm{m}$를 기준으로 large 와 small 로 나누었을 때 개별배양에서는 할구의 크기가 42.0, 50.9$\mu\textrm{m}$로 측정되었으며, 그룹배양에서는 41.6, 50.6$\mu\textrm{m}$로 측정되었다. 수정후 114시간 개별 및 그룹배양된 수정란의 평균할구수는 16.8개와 17.6개로 나타났으며, 할구분리시 할구의 크기는 평균 39.3, 38.7$\mu\textrm{m}$로 나타났다. 두 그룹 모두 38$\mu\textrm{m}$ 를 기준으로 Large 와 small로 나누었을 때 개별배양에서는 할구의 크기가 42.5, 35.2$\mu\textrm{m}$로 측정되었으며, 그룹배양에서는 42.1, 34.8$\mu\textrm{m}$ 로 측정되었다. 3. 핵이식 수정란의 세포융합율에 있어서 수정 후 90시간 개별배양된 수정란의 small 과 large 의 할구를 공핵체로 사용한 처리구에서 69.2 와 72.3%, 그룹배양된 수정란의 small 과 large의 할구를 공핵체로 사용한 처리구에서는 71.6와 76.3%의 융합율을 보여 유의적으로 차이를 나타내지 않았으며, 핵이식 수정란의 배반포기배로의 발달율에 있어서도 각 각 11.1, 10.2, 12.2 그리고 13.0%의 발달율을 보여 유의적인 차이를 보이지 않았다. 4. 수정 후 114 시간 개별배양된 수정란으로부터 분리된 small과 large의 할구를 공핵체로 사용한 처리구에서 핵이식 수정란의 세포융합율에 있어서 각각 71.0, 71.4, 69.9 및 77.1% 의 융합율올 보여 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 핵이식 수정란의 배반포기배로의 발달율에 있어서도 각각 11.4%, 8.0%, 17.2% 그리고 12.9% 의 발달율을 보여 유의적인 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과로 보아 핵이식 수정란을 효율적으로 생산하기 위하여 수핵난자의 세포질에 ionomycin 과 DMAP 의 혼합처리로 탈핵난자의 활성화를 유도하는 것이 효율을 증진시킬 수 있었다고 본다. 또한 공핵수정란을 수정 후 90시간과 114시간 개별 배양하여 할구를 공핵체로 핵이식에 이용하였을 때도 그룹배양에 비하여 효율이 떨어지지 않음을 알 수 있었으며, 수정란의 할구 크기의 차이가 핵이식 수정란의 생산효율에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
