Existence of a binding site for choline esters with an acyl chain of various sizes was examined by comparing the inhibitory potency of the respective compound. In contrast to acetylcholine, which showed a pure competitive pattern of inhibition, choline esters with an acyl chain of a long size ($C{\geq}5$) expressed a mixed type of inhibition. Binding of choline esters containing a long chain ($C_7-C_{12}$) to the hydrophobic region in the active site is deduced from a linear relationship between the $K_{iE}$ value and the size of acyl moiety, and a good hydrophobicity relationship. In addition, the non-competitive component in the inhibition of acetylcholinesterase seems to be due to the interaction of choline esters with both the hydrophobic site and the trimethylammonium-binding site in the active center of the acetylated acetylcholinesterase.
합성된 hexanoylthiocholine을 기질로 하여 butyrylcholinesterase와의 반응을 연구하였다. 기질의 농도 변화에 따른 초기반응속도 관찰을 통해 아실기의 탄소수가 증가함에 따라 반응성은 감소하나 $K_{m}$ 값은 0.140(mM)으로 더 강한 ES 복합체를 형성함을 알 수 있었다. Hexanoylthio-choline의 촉매화된 acetylcholinesterase 가수분해에 대한 pH-V/K profile에서 p $K_{a}$ 값 4.974$\pm$0.02을 얻었다. 이는 최근 문헌의 보고와 상통하는 것으로 p $K_{a}$ =6.2~6.4를 갖는 잔류물의 기본형에 활성이 의존하는 것으로부터 하나의 잔류물 또는 p $K_{a}$ =4.7~5.0을 갖는 잔류물들의 촉매작용으로 계통적인 자리밀림을 보여준다. 이는 촉매화된 BChE의 활성영역 esteratic site 주변에 긴 사슬 아실기의 가수분해에 관여하는 새로운 활성영역이 존재함을 밝히는 증거이다. 분자 조형은 기질의 아실기의 탄소수에 따라 acetylcholinesterase에 의해 표현되어지는 반응과정의 변화의 합리성을 제공한다. 본 연구에서는 한국과학기술원 도핑컨트롤센터와 연계하여 acetylcholinesterase와 기질인 acylthiocholine과의 입체적으로 둘러싸인 acyl-binding site를 분자 조형하고자 노력 중에 있다.
Choline과 choline esters인 acetylcholine, methacholine, carbachol, bethanechol이 토끼의 적출장관 운동에 미치는 영향과 각 약물의 $pD_2$값을 산출하여 각각 비교를 하였다. Choline은 최대유효농도가 $10^{-2}M$이었으며 $ED_{50}$은 $2.4{\times}10^{-3}M$이었고 $pD_2$값은 2.619이었다. Acetylcholine은 최대유효농도가 $10^{-4}M$이었으며 $10^{-9}M$에서는 거의 효과가 나타나지 않았고 $ED_{50}$은 $0.5{\times}10^{-5}M$이었고 $pD_2$값은 5.154이었다. Methacholine은 최대유효농도가 $10^{-5}M$이었으며 $10^{-9}M$에서는 거의 효과가 나타나지 않았고 $ED_{50}$은 $9{\times}10^{-5}M$이었고 $pD_2$값은 6.045이었다. Carbachol은 최대유효농도가 $10^{-5}M$이었으며 $10^{-11}M$에서는 거의 효과가 나타나지 않았고 $ED_{50}$은 $5.7{\times}10^{-7}M$이었고 $pD_2$값은 6.244이었다. Bethanechol은 최대유효농도가 $10^{-4}M$이었으며 $10^{-8}M$에서는 거의 효과가 나타나지 않았고 $ED_{50}$은 $3.3{\times}10^{-6}M$이었고 $pD_2$값은 5.480이었다. Choline esters는 토끼의 적출장관 운동에 대하여 수축을 일으켰으며 각 약물의 potency의 순서는 carbachol이 가장 강하게 나타났고 methacholine, bethanechol, acetylcholine, choline의 순으로 나타났다.
촉매화된 acetylcholine esterase가수분해의 기질로 사용될 choline ester를 두 가지 방법으로 합성하였다. 먼저, ethylene sulfide를 출발물질로 하여 2-chloroethyl thiohex-anoate, 2-chloroethyl thioheptanoate, 2-chloroethyl thiooc-tanoate를 각각 합성하였고 여기에 trimethyl amine을 첨가하여 hexanonyl thiocholine, octanonyl thiocholine을 합성하였다. 두 번째 방법으로 ethylene sulfide에 dimethyl amine을 첨가시켜 acid anhydride로 acylation 시킨 후 methyl iodide를 첨가하여 heptanoyl thiocholine, decanoyl thiocholine을 합성하였다. 합성된 hexanonyl thiocholine을 기질로 하여 butyrylcholine esterase와의 반응을 연구 하고자 한다. 또한 본 연구에서는 한국 과학 기술원 도핑컨트롤 센터와 연계하여 acetylcholine esterase와 기질인 acyl-thiocholine과의 입체적으로 둘러싸인 acyl-binding site를 분자 조형하고자 노력 중에 있다.
검정콩을 chloroform-methanol(2 : 1, v/v) 용매로 추출하여 얻은 총지방질을 SACC로 중성지방질, 당지방질 및 인지방질로 분획하고, 이들의 조성을 TLC에 의하여 분별하였으며, GC에 의하여 지방산 조성을 분석한 결과는 다음과 같다. 검정콩의 총지방질중 중성지방질은 $88.5{\sim}89.2%$, 당지방질은 $2.4{\sim}2.5%$,, 인지방질은 $8.4{\sim}9.0%$였다. 중성지방질 조성중 triglycerides가 주된 성분이었으며, diglycerides, sterols, steryl esters, free fatty acids, hydrocarbons 등을 함유하고 있었다. 당지방질 성분으로는 monogalactosyl diglycerides 및 esterified steryl glycosides, cerebrosides 및 steryl glycodes, digalactosyl diglycerides 등이 분별정량되었으며, 인지방질에서는 phosphatidyl ethanolamine, phosphatidyl choline, phosphatidyl inositol, phosphatidyl serule 및 lysophosphatidyl choline이 분별정량되었다. 검정콩의 지방산 조성은 중성지방질의 경우 linoleic acid 함량이 가장 높고, oleic acid가 상당량 함유되어 있으며, 당지방질도 이와 비슷하나 olelc acid함량이 다소 낮은 반면 palmitic acid와 linolenic acid함량이 약간 높았다. 또한 인지방질은 linoleic acid와 palmitic acid 함량은 높으나 그외는 적은량 함유되어 있었다.
인삼근의 구조적인 차이점에 따른 지질의 함량 및 지방질 조성을 규명하기 위하여 chloroform-methanol로 추출한 지질을 column, thin layer, gas-liquid chromatography에 의하여 분석하였다. 각 부위별 정제 지질은 1.08~2.23%로서 그 조성면에서 볼 때 중성지질은 64.2~73.5%였고 당지질은 15.4~17.4%였으며 인지질은 10.4~19.2%였다. 특히 피층에서는 중성지질의 함량이 가장 높았는데 이는 이곳에만 특징적으로 존재하는 지질분비관에서 합성 분비된 중성지질 때문이라 생각된다. 이러한 점은 조직화학적 관찰 결과 분비관 내강의 분비물질이 nile blue에 적색의 반응을 나타내는 것으로 더욱더 뒷바침 될 수 있었다. 중성지질 획분중에는 triglycerides, sterol esters and hydrocarbons 의 함량이 높았고 그외에 1,3-diglycerides, monoglycerides, 1,2-diglycerides, free sterols, free fatty acids와 미동정된 5종류가 검출되었다. 그러나 중심주에서는 unidentified II, IV 및 V가 검출되지 않은 점이 특이하였다. 당지질 획분 중에는 sterol glucoside, digalactosyl diglyceride 및 esterified sterol glucoside가 주성분이었고 미동정된 6종류가 검출되었다. 인지질 획분 중에는 phospatidyl glycerol, phosphatidyl choline과 phosphatidyl ethanolamine이 주성분이었고 그 외에 phosphatidic acid, phosphatidyl inositol 및 미동정된 2종이 검출되었다. 각 부위별 중성지질, 당지질, 인지질 획분 중에서 모두 18종류의 지방산이 동정되었는데 주요지방산은 linoleic acid, palmitic acid, oleic acid 및 linolenic acid였으나 각 지방산의 함량은 부위별 및 지질분획에 따라서 다소 상이하였다.
잣(Pinus koraiensis S & Z)에서 얻은 총지질 성분을 silicic acid column chromatography에 의해 중성지질, 당지질, 인지질로 분획 정량하고, 다시 이 분획된 성분을 thin layer chromatography 로써 재분리시켜 구성성분들을 분별하고 scanner에서 정량하였으며, 각 획분별 지방산 조성을 gas chromatography로써 분석한 결과는 다음과 같다. 1) 잣지질의 구성은 중성지질이 총지질의 $95.9{\sim}96.7%$, 당지질이 $2.5{\sim}3.2%$, 인지질이 $0.8{\sim}0.9%$였으며, 중성지질에서는 triglyceride(80.8%), diglyceride(6.3%), free fatty acid(5.2%), sterol(4.6%) ,sterol ester 및 hydrocarbon 등이 분별 정량되었으며, 이 중 triglyceride가 주된 물질이었다. 당지질에서는 monogalactosyl diglyceride 및 esterified sterylglycoside(23.5%), cerebroside 및 steryl glycoside(7.8%), digalactosyl diglyceride(2.3%) 등이 분별정량되였고, 인지질의 획분에서는 phosphatidyl cho-line(40.2%), phosphatidyl ethanolamine(19.4%), phosphatidyl inositol(7.3%), lysophosphatidyl choline(5.8%), phosphatidyl serine(2.6%) 등이 분별 정량되었다. 2) 각 분획된 지질의 지방산 조성은 중성지질의 경우 linoleic acid(48.7%), oleic acid(28.8%), arachidic acid(14.4%), palmitic acid(5.7%), stearicacid(1.84%), linolenic acid(0.7%), myristic acid(0.1% 이하), lauric acid(0.1% 이하) 등이 분리 정량되었으며, 당지질과 인지질에서도 linoleic acid, oleic acid등이 주성분으로 이루어져 있었다. 그러나 인지질의 경우 palmitic acid(17.7%)와 stearic acid(6.0%)의 함량이 다른 지질획분에 비해 다소 많았다.
수침이 진행되는 동안 한국산 검정콩의 수분 흡수는 수침 초기에 상당히 빠른 속도로 진행되었고 균일하게 완전히 수화(hydration)되는 시간은 약22시간 정도였다. 검정콩의 총지질중 중성지질은 89.1%, 당지질은 1.5%, 인지질은 9.4%였으며, 수침 후에도 그 조성은 비슷하였다. 그리고 중성지질 성분은 triglycerides(92.1%)가 대부분이었고 그 외 sterol esters와 hydrocarbons (3.0%), diglycerides (2.8%), free fatty acids (1.5%), free sterols (0.3%), monoglycerides (0.3%)순으로 함유되어 있었고, 수침 후에도 그 조성은 크게 변화하지 않았다. 당지질 성분은 esterified steryl glycosides(43.6%), steryl glycosides (26.6%), digalactosyl diglycerides(14.5%) 등이 주성분이었고 이러한 성분들은 수침으로 인해 약간 변화하였다. 인지질 성분은 phosphatidyl choline(41.6%) 및 phosphatidyl ethanolamine(39.5%)등이 가장 않았으며 이러한 성분들은 수침 과정 중 다소 감소하였고 phosphatidyl serine, phosphatidyl inositol, lysophosphatidyl choline등의 성분들은 약간 증가하였다. 총지질의 지방산 조성은 linoleic acid (51.1%), oleic acid (23.1%), palmitic acid(11.8%)등이 주성분으로 구성되어 있었고 중성지질에서는 이와 유사한 경향이었으나, 당지질과 인지질에서는 palmitic, linoleic acid등의 함량이 많았다. 수침 과정중 총지질, 중성지질의 지방산 조성 변화는 거의 없으나, 당지질의 지방산 조성은 미량씩의 증감의 변화가 있었고 인지질의 지방산 조성은 palmitic, oleic acid 등은 증가에 비해 linoleic, linolenic acid 등은 감소하였다.
Lipid and fatty acid compositions of free lipids and bound lipids from fresh ginseng, red ginseng and white ginseng were studied by means of silicic acid column chromatography, thin-layer chromatography and gas-liquid chromatography. Free lipid and bound lipid contents in those three samples were 1.21 to 1.45% and 0.32 to 0.45%. Neutral lipid fractions in free lipids from the samples were 76.6 to 79.7%, while glycolipid and phospholipid fractions were 11.6 to 14.7% and 8.5 to 8.7%, respectively. The major lipids were triglycerides, sterol esters and hydrocarbons, diglycerides and free sterols in neutral lipids, sterol glucoside, monogalactosyl diglyceride, esterified steryl glycoside, digalactosyl diglyceride in glycolipids and phosphatidyl ethanolamine, phosphatidyl glycerol, phosphatidyl choline and phosphatidyl inositol in phospholipids. Fourteen kinds of even numbered and four kinds of odd numbered fatty acids were identified in the four lipid fractions (TL, NL, GL and PL) by GLC, and the main fatty acids were linoleic acid, palmitic acid, oleic acid and linolenic acid.
Lipid and fatty acid compositions of the free lipids in Panax ginseng (Korea, Japan and China), Panax quinquefolium (America, Canada) and Panax notoginseng (China) were studied by means of silicic acid column chromatography, thin-layer chromatography and gas-liquid chromatography. Free lipid contents were 1.13 to 1.24% in panax ginseng and 0.87 to 1.18% in Panax quinquefolium and 0.39% in panax notoginseng. Neutral lipid fractions were 81.2 to 84.4%, while glycolipid fractions 8.01% to 14.47% and phospholipid fractions 3.49 to 5.74% in free lipid contents. The major components were triglycerides, free sterols, diglyceride, free fatty acids and sterol esters in neutral lipid fractions, sterol glucoside, monogalactosyl diglyceride, digalactosyl diglyceride, esterified steryl glucoside in glycolipid fractions and phosphatidyl glycerol, phosphatide, ethanolamine, phosphatidyl choline in phospholipid fractions. The contents and compositions of neutral lipids and glyclipids were some different among various ginsengs, whereas phospholipids showed relatively similar compositions in the contents. Seventeen fatty acids were analyzed in the four free lipid fractions from the various ginsengs and the main fatty acids were linoleic acid, palmitic acid, oleic acid and linolenic acid. It was found that the amounts of some fatty acids were different among the various ginsengs, but the fatty acid patterns of these ginsengs were on the whole similar.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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