전장 cDNA 클론을 시퀀싱하는 것은 선택적 스플라이싱 형태를 비롯한 정확한 유전자 구조를 정의하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 유전자 및 단백질의 생물학적 기능연구에 중요한 자원을 제공한다. 포괄적이며 비 중복적인 cDNA의 생산은 인간 유전체 연구의 중요한 목표이다. 본 연구에서 제공하는 인간 cDNA 라이브러리 분석 파이프라인은 전장 cDNA를 분석하는 자동화 도구로 여러 연구자들에게 활용 될 수 있을 것으로 사료된다.
전장 cDNA 클론을 시퀀싱하는 것은 선택적 스플라이싱 형태를 비롯한 정확한 유전자 구조를 정의하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 유전자 및 단백질의 생물학적 기능연구에 중요한 자원을 제공한다. 포괄적이며 비 중복적인 cDNA의 생산은 인간 유전체 연구의 중요한 목표이다. 본 연구에서 제공하는 인간 cDNA 라이브러리 분석 파이프라인은 전장 cDNA를 분석하는 자동화 도구로 여러 연구자들에게 활용 될 수 있을 것으로 사료된다.
골격근 세포는 미분화 단핵 근원세포로부터 신장과 융합을 거쳐 다핵 횡문근섬유로 분화되어 가며 동시에 근특이 유전자의 발현이 선택적으로 일어난다. 본 연구에서는 계배 배양 근원세포의 분화동안 유전자 발현 조절 양상에 대한 연구를 위해, 계배 근원세포를 72시간 배양한 근섬유로부터 CDNA 라이브러리를 제작하였다. 이 cDNA 라이브러리를 미분화 단핵 근원세포(배양 36시간)와 분화된 다핵 근섬유(배양 72시간)의 poly(A)+ RNA 주형에서 합성된 [32P〕cDNA를 Probe로 사용한 differential plaque hybridization 방법으로 스크리닝하였다 분화된 다핵 근섬유 CDNA probe에 강한게 흔성화되는 CDNA clone을 선별하여 클로닝하였다. 선별한 CDNA clone 들 중 하나는 약 1.3 Kb 크기의 삽입절편을 갖고 있는 것으로 나타났고, 이 CDNA를 probe로 사용하여 northern blotting 한 결과, 이 CDNA엑 대한 유전자는 미분화 단핵 근원세포에서 분화된 다핵 근섬유로 분화가 진행됨에 따라 유전자 산물인 RNA 양이 증가되는 것으로 나타났다 또한 이 1.3 Kb CDNA에 대한 RNA의 크기는 약 2 7 Kb로 확인되었다.
순천만 갯벌의 세균 군집의 다양성을 조사하기 위해 16S rDNA의 다양성을 조사하였다. 갯벌로부터 전체 핵산을 분리한 후, 세균에 상보적인 universal primer로 증폭된 16S rDNA로부터 클론 라이브러리를 만들었다. 총 111개의 클론으로부터 HaeIII를 이용하여 amplified rDNA restriction analysis (ARDRA)를 수행하고, Gelcompar II 프로그램을 이용하여 pattern을 clustering하였다. 111개의 클론 중 100가지의 서로 다른 RFLP type이 조사되었고, 이들 중 전체 클론 라이브러리를 대표할 수 있는 20개의 클론을 선별하여 부분적인 염기서열을 분석하여 세균 다양성을 분석하였다. 20개의 클론중에는 RDP와 GenBank에서 제공하는 small subunit RNA database와 동일한 클론은 존재하지 않았으며, 이미 알려진 배양 가능한 세균의 16S rRNA 염기서열과 비교 하였을때 77∼96.8%의 유사도를 보였다. 또한 이들 20개의 클론은 alpha-, delta-, gamma-Proteobacteria, low G+C Gram positive bacteria, high G+C Gram positive bacteria, Sphingobacteria (Cytophaga); Cyanobacteria (Chloroplast)등 주요한 7개 lineage에 속했으며, 클론들 중 Proteobacteria가 우점종을 차지하고 있었다.
배양 중의 골격근 세포는 증식을 거쳐 세포융합을 통해 다핵세포로 분화되므로 세포분화의 연구에 좋은 모델로서 이용되고 있다. 이전 실험에서 근원세포 융합을 억제하는 단일클론항체(MII-3J31)가 제작되었으며(Kim et al., 1992)이 항체에 대한 항원은 분자량이 약 35 kDa인 세포막 단백질로 추정되었다. 본 실험에서는 13일 계배와 성체의 근섬유 mRNA에서 CDNA라이브러리를 제작하여 근원세포 분화에 특이적으로 나타나는 유전자를 추적하였다. 근원세포 융합에 관여하는 단백질에 대한 CDNA는 계배 13일 째의 근원세포 CDNA라이브러리에서 단일클론항체를 사용한 immunoscreening 방법을 이용하여 확인하였다. 이 CDNA의 크기는 약 1.5 kb였다. 한편 13일 계배와성체 근섬유 CDNA 라이브러 리를 이용하여 13일 계배에만 특이하게 유전자 발현 이 일어 나고 성체에서는 나타나지 않는 약 0.8 kb의 CDNA플 찾았다.
점액질이 풍부한 꼼치 조직에서 NIH 3T3 세포주를 이용하여 subtracted cDNA 라이브러리를 얻어 200례의 클론을 제작하였다. 이 클른 중에서 비반복성 유전자를 선택하고, RNA in situ hybridization을 실행하여 꼼치 조직에서 특이하게 발현되는 곰신 클론(C90-171)을 선택하였다. 이 클론은 사람의 타액선 조직에서도 특이하게 발현되는 유전자로서 이를 확인하기 위하여 C90-171(곰신) 항체를 제작하였다. 꼼치의 cDNA 라이브러리에서 곰신의 항체를 통하여 스크리닝한 결과 PRP(proline-rich protein)와 가장 많이 교차반응하며, 면역조직화학적 염색으로 PRP와 유사한 양성반응으로 나타나 PRP와 유사한 기능을 하는 단백질로 사료된다. 또한 타액 내에서의 꼼치 단백질의 분해에 대한 실험결과 거의 분해가 일어나지 않는 것으로 보아, 곰신은 꼼치의 몸통을 보호하는 유전물질일 뿐만 아니라, PRP와 유사하게 조직을 보호하는 안정된 새로운 기능성 단백질로 사료된다.
본 연구는 진단용 DNA 칩의 자동판독 시스템을 제안하는 것을 목적으로 한다. 일반적인 자동판독 시스템의 사양을 정의하고 그 구현방법을 제안하였다. 응용 예로서 자궁경부암 진단용 DNA 칩을 대상으로 GenePix 스캐너 프로그램 환경에 적용하였다. 영상획득은 GenePix 의 라이브러리를 사용하여 HTML 언어로 구현하였고, 영상의 판단과 보고서 생성은 Microsoft Visual C++ 6.0를 사용하여 COM 형태로 구현하였다. 결과 보고서는 한글 2002 문서에 환자 정보와 결과 정보 등에 해당하는 곳에 미리 정의된 표지문자열들을 삽입하여 템플릿을 만들었다. 판독 시스템은 템플릿을 읽어들여 처리 결과의 내용으로 표지문자열들을 치환하여 보고서를 생성하였다. 제안한 시스템을 통해서 스캐닝을 통한 영상획득, 영상읠 판독, 결과 보고서 생성으로 구성된 전체 판독과정이 사용자의 개입 없이 자동으로 처리될 수 있었다. 본 시스템은 기존에 수작업을 자동화여 판독 시간을 단축하고 판독 기준을 정량화하여 진단용 DNA 칩이 대량검사 활용되는 공헌할 것으로 기대된다.
사람의 미토콘드리아에 있는 aldehyde dehydrogenase(ALDH2)는 체내에서 알코올 대사 과정 중에 생성되는 아세트알데히드를 산화시키는 주된 역할을 담당하고 있다. 이 ALDH2가 알코올 대사에 미치는 영향을 연구하기 위하여 가용화된 효소가 필요하다. 알려져 있는 유전자의 염기서열 데이터를 바탕으로 ALDH2의 cDNA는 cDNA 라이브러리에서 선별하였으며, 이를 여러 가지 대장균 발현벡터에 연결하였다. 제조한 발현벡터를 형질전환시킨 대장균을 사용하여 단백질의 발현을 확인한 결과 대부분의 계에서 ALDH가 과발현되고 있었다. 그러나 발현된 단백질의 대부분은 inclusion body로 형성되어, 실제로 가용화된 효소의 양은 전체 발현된 양의 5% 이하 였고 이들 몇 가지 발현 system으로 재조합 미오2DML 발현을 확인하였다.
NGS (Next-generation sequencing), 즉 차세대염기서열분석은 유전체 수준의 방대한 DNA를 작은 절편으로 만들어서 그 절편들의 염기서열들을 동시에 읽어내는 기법이다. 현재 다양한 생명체의 유전체 염기서열 분석부터 cDNA (complementary DNA)나 ChIPed DNA (chromatin immunoprecipitated DNA)를 분석하는데 이 NGS 기법을 사용하고 있으며, 이 때 얻어진 데이터를 적절히 처리하고 분석하는 일은 생물학적으로 유의미한 결과를 얻기 위하여 중요하다. 하지만 대용량 데이터의 저장 및 활용, 그리고 컴퓨터 프로그래밍 바탕의 데이터 분석은 실험을 수행하는 일반 생물학자들에게 어려운 일이다. Galaxy 플랫폼은 다양한 NGS 데이터 분석 tool을 무료로 제공하는 웹 서비스이며, 생물정보학이나 프로그래밍에 대한 전문지식이 없는 연구자들에게 웹 브라우저만을 이용하여 데이터를 분석할 수 있는 환경을 제공한다. 본 논문에서는 ChIP-seq (chromatin immunoprecipitation-sequencing) 수행을 위한 라이브러리 제작 과정 및 Galaxy 플랫폼을 이용한 ChIP-seq 데이터 분석 과정을 설명하고, K562 세포주에서 수행한 히스톤 H3K4me1 ChIP-seq 결과가 public 데이터와 일치함을 보여준다. 따라서 Galaxy 플랫폼을 활용한 NGS 데이터 분석은 생물정보학에 대한 손쉬운 접근 방법을 제공할 것으로 기대된다.
더덕 뿌리에서 유래한 EST 라이브러리로부터 dehydrin 유전자와 높은 상동성 을 나타내는 full clone cDNA를 얻었다. 더덕의 dehydrin, ClDhn1은 893 bp의 cDNA로 159개의 아미노산을 코딩하는 480 bp의 ORF를 가지고 있다. ClDhn1의 아미노산을 분석해 보면, 전체적으로 높은 친수성을 나타내며, lysine이 풍부한 K 반복구간(KIKEKLPG)을 카르보닐기 쪽에 2개 가지고 있다. 또한, 여러 dehydrin들의 공통적인 특징인 7개의 연속적인 serine잔기가 첫 번째 K반복 구간 앞에 위치한다. 그러나, 아미노기쪽의 DEYGNP보존 구간은 변형(DEHGNP)되어 있다. ClDhn1 유전자는 전사 단계에서 더덕의 뿌리에서 가장 높은 발현 양상을 보이며, 줄기와 잎에서는 적은 양이 발현되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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