• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제33권12호
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• pp.2021-2030
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• 2020

Objective: Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) has been extensively used in the field of mesenchymal stem cell (MSC) research to elucidate their characteristics and clinical potential by normalization of target genes against reference genes (RGs), which are believed to be stably expressed irrespective of various experimental conditions. However, the expression of RGs is also variable depending on the experimental conditions, which may lead to false or contradictory conclusions upon normalization. Due to the current lack of information for a clear list of stable RGs in bovine MSCs, we conducted this study to identify suitable RGs in bovine MSCs. Methods: The cycle threshold values of ten traditionally used RGs (18S ribosomal RNA [18S], beta-2-microglobulin [B2M], H2A histone family, member Z [H2A], peptidylprolyl isomerase A [PPIA], ribosomal protein 4 [RPL4], succinate dehydrogenase complex, subunit A [SDHA], beta actin [ACTB], glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase [GAPDH], TATA box binding protein [TBP], and hypoxanthine phosphoribosyltrasnfrase1 [HPRT1]) in bovine bone marrow-derived MSCs (bBMMSCs) were validated for their stabilities using three types of RG evaluation algorithms (geNorm, Normfinder, and Bestkeeper). The effect of validated RGs was then verified by normalization of lineage-specific genes (fatty acid binding protein 4 [FABP4] and osteonectin [ON]) expressions during differentiations of bBMMSCs or POU class 5 homeobox 1 (OCT4) expression between bBMMSCs and dermal skins. Results: Based on the results obtained for the three most stable RGs from geNorm (TBP, RPL4, and H2A), Normfinder (TBP, RPL4, and SDHA), and Bestkeeper (TBP, RPL4, and SDHA), it was comprehensively determined that TBP and RPL4 were the most stable RGs in bBMMSCs. However, traditional RGs were suggested to be the least stable (18S) or moderately stable (GAPDH and ACTB) in bBMMSCs. Normalization of FABP4 or ON against TBP, RPL4, and 18S presented significant differences during differentiation of bBMMSCs. However, although significantly low expression of OCT4 was detected in dermal skins compared to that in bBMMSCs when TBP and RPL4 were used in normalization, normalization against 18S exhibited no significance. Conclusion: This study proposes that TBP and RPL4 were suitable as stable RGs for qPCR study in bovine MSCs.

• 생명과학회지
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• 제20권11호
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• pp.1577-1581
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• 2010

조혈촉진 cytokine인 Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF)는 골수세포를 자극하여 granulocyte로 증식, 분화시키는 기능을 가지며, 현재 아주 고가의 치료제로 사용되고 있다. 인간 G-CSF (hG-CSF)를 아직 시도되지 않은 누에 유래 세포주인 BM5 세포에서 발현시키고 생산 효율을 높이기 위해 hG-CSF cDNA를 변형하였다. hG-CSF의 cDNA의 endoplasmic reticulum (ER) signal sequence 부분을 누에의 소포체에서 분비되는 단백질인 prophenoloxidase (PPAE), protein disulfide isomerase (PDI)와 bombyxin (BX)에서 유래한 누에특이 ER signal sequence로 대체한 hG-CSF의 cDNA 함유 벡터를 구축하였다. 이들 벡터를 사용하여 형질전환한 BM5 세포의 배양액에 분비된 G-CSF 단백질을 western blot으로 분석하여 발현을 확인하였다. 누에특이 ER signal sequence들로 대체된 hG-CSF cDNA를 포함하는 벡터에 의한 hG-CSF 단백질 생산이 인간 G-CSF cDNA가 든 벡터에 의한 hG-CSF의 생산보다 월등히 효율적이었다. 또한, PPAE-signal sequence를 포함하는 hG-CSF 단백질은 배양배지에서 형질전환 4일 후에 최고에 달하였고, 7 일째까지 비슷한 양이 배지 내에서 검출되었다. 이상의 결과는 인간유래 유전자가 곤충세포 내에서 발현 될 때 인간유래 유전자 보다는 곤충 유전자발현 시스템에 맞게 변형했을 경우 더 효율적인 단백질 발현을 얻을 수 있음을 보여 준다.

• 동의생리병리학회지
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• 제23권5호
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• pp.1106-1115
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• 2009

Mori Ramulus has multiple applications in Korean traditional medicine prescription because it has antioxidant and anti-inflammatory effects by reducing macrophage activities. Yet, no studies on the anti-arthritic activity of EMR (extract of Mori Ramulus) have been reported in vitro and in vivo. Rheumatoid arthritis (RA) is a systemic autoimmune disease with chronic inflammation characterized by hyperplasia of synovial cells in affected joints, which ultimately leads to the destruction of cartilage and bone. Because collagen-induced arthritis (CIA) is similar to RA in pathological symptoms and immune reactions, there have been several reports concerning RA using CIA mouse model. Here, we investigated the effects of Mori Ramulus on RA using CIA mice. The importance of CD4+ Th1 cells in RA progress was previously indicated and studies further showed that Th17 cells play a prime role in severity of disease. Accordingly, the present study was focused on CIA associated with CD4+ Th1 cells and Th1 7 cells. DBA/1OlaHsd mice were immunized with bovine type II collagen (CII). After a second collagen immunization, mice were treated with EMR once a day for 4 weeks. The severity of arthritis within the paw joints was evaluated by histological assessment of cartilage destruction and pannus formation. Immune cells in peripheral blood mononuclear cells (PBMC), draining lymph node (DLN) and paw joints, cytokine production and gene expression were assessed from CIA mouse using ELISA, FACS and real-time PCR analysis. Administration of EMR significantly suppressed the progression of CIA and inhibited the production of TNF-$\alpha$, IL-6 and IL-17 in the serum. The erosion of cartilage was dramatically reduced in mouse knees after treatment with EMR. In conclusion, our results demonstrate that EMR significantly suppressed the progression of CIA and that this action was mediated by the decreased production of TNF-$\alpha$, IL-6, IL-17 and collagen II-specific antibody in the serum. EMR suppressed Th17 cells and reduced level of IL-6 via B cell suppression, and thus, the levels of autoantibodies produced from B cells were decreased. Furthermore, EMR suppressed NKT cells which directly stimulate B cells and develop imbalance of Th1/Th2 cell. Oral administration of EMR (100 mg/kg or 200 mg/kg) significantly suppressed the progression of CIA, which is comparable to that of methotrexate (MTX, 0.3 mg/kg) used as a positive control. We are currently studying the mechanism underlying the therapeutic role for EMR in CIA mice.

• 대한소아치과학회지
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• 제30권4호
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• pp.643-653
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• 2003

막내골화와 연골내골화 등의 정상적인 골격 성장은 섬유아세포 성장인자 (FGF) 와 이들 수용체들 (FGFR) 에 의한 신호 전달체계에 의해 조절된다. 또한 전사조절인자인 Runx2 ($Cbfa1/Pebp2{\alpha}A/AML3$) 는 골아세포분화 뿐만 아니라 골형성에도 필수적인 유전자로 알려져 있다. FGF signaling이 mouse의 두개관과 하악에서의 연골 형성에 어떤 영향을 미치고 있으며, 이 과정에서 Runx2의 연관성을 알아보고자 in vivo 및 in vitro 실험을 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 두개관과 하악을 Alcian blue 염색한 결과 시상두개봉합부 연골은 태생 16일부터, Meckel's 연골은 태생11일부터 형성되기 시작하였다. 이들 연골세포들의 성상을 알아보기위한 in situ hybridization 결과 시상두개봉합부 연골 및 Meckel's 연골 모두에서 type II collagen은 발현되었으나, Type X collagen은 발현되지 않았다. Runx2 mRNA는 시상두개봉합부 연골과 Meckel's 연골 모두에서 발현되지 않았지만, 이들 연골들의 가장자리를 둘러싸고 있는 독특한 발현양상을 나타내었다. 두개봉합부에서의 FGF2 protein의 국소적 적용은 두개봉합부 하방의 연골형성을 억제하였다. 또한 하악의 Meckel's 연골 발생 부위에 FGF2 protein의 국소적 적용 역시 Meckel's 연골의 형성을 억제하였다. FGF2 protein은 시상두개봉합부상의 bead 주위로 Runx2의 발현을 유도하였다. 이 결과들을 종합해볼 때, FGF signaling은 골아세포와 연골아세포가 공존하고 있는 조직에서의 연골 형성을 억제하고 있음을 시사해 주고 있으며, 이 과정에서 FGF signaling은 부분적으로 Runx2 유전자의 발현을 조절하므로써 연골세포의 증식과 분화에 관여할 것으로 사료된다.

• 폴리머
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• 제32권2호
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• pp.109-115
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• 2008

탈미네랄화된 골분(DBP)은 사이토카인과 같은 다양한 생리활성분자를 가지기 때문에 조직공학분야에서 널리 사용되는 생체재료이다. 본 연구에서는 DBP를 함유한 2차원적 DBP/PLGA 필름이 추간판디스크 세포의 부착, 증식 및 표현형유지에 미치는 영향에 대해 연구하였다. DBP 함량에 따른 DBP/PLGA 필름은 용매증발법으로 제조하였으며 제조된 PLGA 및 DBF/PLGA 필름은 시차주사현미경을 통해 표면을 분석하였다. PLCA 필름은 매끄러운 표면을 가지며, DBF의 함량이 증가할수록 DBP/PLGA 필름의 표면은 거침도가 증가하는 것을 확인하였다. 섬유륜(AF) 및 수핵(NP)세포를 PLGA 및 DBP/PLCA 필름 표면에 파종하여 배양한 후, 세포의 계수 및 SEM 관찰을 통하여 이들의 부착과 증식을 평가하였다. 세포 계수와 SEM 관찰 결과, DBP의 함량이 10 및 20%인 DBP/PLGA 필름에서 높은 초기부착도 및 증식률을 보였다. 세포 계수 결과를 바탕으로 RT-PCR을 통하여 DBF 10%와 20%의 DBP/PLGA 필름에서의 디스크 세포의 특이적 유전자 발현확인 결과, DBF의 함량이 20%인 DBP/PLCA 필름에서 세포의 표현형이 유지되며 지속적인 세포외기질이 발현될 것으로 예상되었다. 따라서 적절한 천연재료의 함량이 세포의 부착과 증식에 더욱 적합하며 이는 조직공학적 디스크 재생의 기초 자료로 사용될 것으로 사료된다.