• 한국식품과학회지
• /
• 제22권6호
• /
• pp.611-617
• /
• 1990

Vitamin $B_{12}$의 생산성을 높이기 위하여 Bacillus natto와 vitamin $B_{12}$ 생산균주로 알려진 Bacillus megaterium IAM 1166 균주간의 종간 원형질체 융합을 시도하였다. 변이원 처리에 의해 활성이 우수하며 genetic marker로써 $thr^-try^-rif^r$인 Bacillus natto SH-34 및 $arg^-ade^-lys ^-str^r$의 genetic marker를 가진 Bacillus megaterium BK-13을 분리하였다. 원형질체 융합을 행하기 위하여 $500\;{\mu}g/ml$ lysozyme 처리시 원형질체 형성률과 재생률은 99% 및 67%를 나타내었다. 변이주 Bacillus natto SH-34 및 Bacillus megaterium BK-13간에 $1.0{\times}10^{-5}$을 나타내었다. 융합주 MNF-72는 vitamin $B_{12}$ 생산용 배지에서 $7.85\;{\mu}g/ml$의 높은 생산성을 나타내었으며, 융합주 MNF-72를 sodium alginate로 고정화를 하여 회분식 및 연속식 발효를 행하였을 때 72시간에 $0.58\;{\mu}g/ml.hr$ 및 $0.80\;{\mu}g/ml.hr$의 vitamin $B_{12}$를 생산하였다.

• Applied Biological Chemistry
• /
• 제42권1호
• /
• pp.20-28
• /
• 1999

Biopolymer를 생산하는 Bacillus속의 균주개량의 목적으로 biopolymer를 생산하는 균주인 Bacillus subtilis K-1과 유당 이용능이 있는 Bacillus coagulans의 원형질체 형성과 재생에 관하여 조사하였다. 영양요구성과 항생제 내성의 marker가 부여된 두 변이주의 원형질체 형성조건에서 Bacillus subtilis mutant SM-2의 경우, 대수기 중기에 penicillin G(1.0 unit/ml)를 첨가한 다음 1.5시간 반응 후 삼투압 안정제로서 0.4 M sucrose와 $25\;{\mu}g/ml$의 lysozyme이 함유된 lysis fluid(LF, pH 7.0)내에서 $37^{\circ}$, 40분간 반응시켰을 때, 원형질체 형성율은 99.6%, 세포벽 재생율 2.4%였다. Bacillus coagulans mutant CM-12의 경우 대수기 중기에 penicillin G 0.3 unit/ml와 glycine 0.5%를 혼합첨가하고 1시간 반응시킨 후 삼투압 안정제로서 0.6 M lactose와 $300\;{\mu}g/ml$의 lysozyme이 함유된 LF(pH 7.0)내에서 $37^{\circ}$, 30분간 재생시켰을 때, 원형질체 형성율 90.8%, 세포벽 재생율 2.2%였다. 세포벽 재생효율을 높이기 위한 재생배지는 trypticase soy broth(TSB)에 0.4 M sucrose, 0.7% casamino acd, 1% PVP, 25 mM $CaCI_2$, 25 mM $MgCI_2$, 1.5% agar가 함유된 배지에 0.4% soft agar로서 중층 했을 때 Bacillus subtilis SM-2의 재생율은 5.1%, Bacillus coagulans CM-12의 재생율은 10.3%로 $2{\sim}4$배 가량 향상 되었다.

• 미생물학회지
• /
• 제28권1호
• /
• pp.47-54
• /
• 1990

섬유소를 분해할 수 있는 Cellutomonas flavigena NCIB 12901 과 Cellulomonas bibula NCIB 8142의 종간 원형질체 융합을 하고 그로부터 얻은 융합체의 특성을 조사하였다. C. bibuta의 원형질체는 lysozyme(600Ieιllulomoηas libula NCIB 8142의 종간 원형 섣처l 융 한응 하고:1로부터 얻은융합셰익 특성을 조사하였다 . C bibula의 원형선셰는 lysozyme $600{\mu}{\textrm{g}}$/ml)를 6시간 처리하여 얻었으며, 삼투안정제로는 O.5M sorbitol의 최저이었고 원형질체 재생률은 6.7%였다. 원형질체 융합은 25mM $CaCl_{2}$를 포함하는 40% PEG (M.W.6000)를 $30^{\circ}C$에서 30분간 처리함으로 수행하였고 C. bibuιl와 C. flavigeηa의 융합 빈도는 $5\times 10^{-4}$으로 원형질체 형성 및 합체를 얻었고, 모균주와 융합체의 영양요구성, 항생물질 내성, 효소활성, 세포벽 성분, 운동성 등을 비교하여 융합체는 모균주의 재조합체임을 밝히었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제20권8호
• /
• pp.1196-1203
• /
• 2010

In the present work, methanethiol and dimethyldisulfide were investigated as sulfur sources for methionine synthesis in Corynebacterium glutamicum. In silico pathway analysis predicted a high methionine yield for these reduced compounds, provided that they could be utilized. Wild-type cells were able to grow on both methanethiol and dimethyldisulfide as sole sulfur sources. Isotope labeling studies with mutant strains, exhibiting targeted modification of methionine biosynthesis, gave detailed insight into the underlying pathways involved in the assimilation of methanethiol and dimethyldisulfide. Both sulfur compounds are incorporated as an entire molecule, adding the terminal S-$CH_3$ group to O-acetylhomoserine. In this reaction, methionine is directly formed. MetY (O-acetylhomoserine sulfhydrylase) was identified as the enzyme catalyzing the reaction. The deletion of metY resulted in methionine auxotrophic strains grown on methanethiol or dimethyldisulfide as sole sulfur sources. Plasmid-based overexpression of metY in the ${\Delta}$metY background restored the capacity to grow on methanethiol or dimethyldisulfide as sole sulfur sources. In vitro studies with the C. glutamicum wild type revealed a relatively low activity of MetY for methanethiol (63 mU/mg) and dimethyldisulfide (61 mU/mg). Overexpression of metY increased the in vitro activity to 1,780 mU/mg and was beneficial for methionine production, since the intracellular methionine pool was increased 2-fold in the engineered strain. This positive effect was limited by a depletion of the metY substrate O-acetylhomoserine, suggesting a need for further metabolic engineering targets towards competitive production strains.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제19권1호
• /
• pp.76-81
• /
• 1991

2l 발효조에서 pH6.9, 온도 $32^{\circ}C$일 때 당밀배지를 이용하여 Corynebacterium glutamicum의 영양요구성 유사체 내성변이주에 의한 라이신 발효시 산화환원 전위 (ORP)가 라이신 발효속도의 특성에 미치는 영향을 조사하였다. 희석률이 0.1$h ^1$일때 탄소원이 제한되건 로이신이 제한되건 산소가 제한되지 않는 한 최대의 대당수율 24를 보였으며, 이 때의 산화환원 전윈 값은 -60mV와 -100mV 범위에 해당하였다. 산화화원 전위 값이 -130mV의 매우 낮은 용존산소 조건하에서는 대당수율 밀 $q_s, q_p$ 등의 발효 반응속도 상수값들이 크게 감소하였으며 glvcine, alanine, valine을 포함하는 발효 부산물의 축적량이 매우 높아졌다.

• 한국균학회지
• /
• 제17권3호
• /
• pp.154-160
• /
• 1989

핵전이 기술을 이용하여 Aspergillus nidulans에서의 종내잡종들을 얻어내고 이들의 섬유질 분해효소계 활성 및 핵형분석을 통하여 이 방법에 의한 균주개량의 가능성을 조사하였다. A. nidulans 야생균주와 영양요구성 돌연변이주 FGSC 475로부터 추출한 핵을 FGSC 514의 원형질체에 각각 전이시킨 결과 4.8% 및 10.1%의 잡종형성율을 나타냄으로써, 0.6%의 융합빈도를 보인 원형질체 융합법보다 핵전이법이 잡종형성에 더 효과적임을 알 수 있었다. 또한 형성된 잡종들에서 cellulase및 xylanase system과 mannanase 중 일부분의 효소성분의 활성이 향상된 균주가 분리되어 이 방법에 의한 우수 섬유질분해 균주개발의 가능성을 확인할 수 있었으며, 형성된 잡종의 핵형은 이배체 또는 이수체로 분석되었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제3권4호
• /
• pp.232-237
• /
• 1993

A strain of yeast which can convert starch directly to ethanol was developed by the intergeneric protoplast fusion between Schwanniomyces alluvius possessing $\alpha$ amylase as well as glucoamylase with debranching activity and FSC-14-75 which previously had been formed from a heterologous transformation and subsequent intergeneric protoplast fusion. Fusants were selected on minimal medium after protoplasts of auxotrophic mutant of S. alluvius fused with heat-treated protoplasts of FSC-14-75 in the presence of 30%(w/v) PEG and 20 mM $CaCl_2$. The fusion frequency was in the range of $10^{-6}$ order. All fusants tested were intermediate types of parental strains for carbon compound assimilation, and their cell volumes were approximately 1.1 times larger than FSC-14-75 and 1.8 times larger than S. alluvius. The fusants were unable to sporulate like FSC-14-75, while S. alluvius could sporulate. In flask scale the most promising fusant, FSCSa-R10-6, produced 7.83%(v/v) and 10.17%(v/v) ethanol from 15% and 20% of liquefied potato starch, respectively, indicating that the fermetation efficiency of each case increased 1.2 times and 1.6 times than that of FSC-14-75. The elution pattern on DEAE-cellulose chromatography showed that FSCSa-R10-6 has four distinct amylase peaks of which two peaks originated from S. alluvius and the other two from FSC-14-75. These results suggest that the enhanced fermentation efficiency of the fusant might be due to almost-complemented parental amylases.

• 한국버섯학회지
• /
• 제9권3호
• /
• pp.91-95
• /
• 2011

느타리버섯은 가장 중요한 식용버섯 중 하나이다. 느타리버섯은 Pseudomonas tolaasii에 의한 세균성 갈변병에 매우 감수성이므로, 저항성 품종을 만들기 위한 노력의 하나로 누에에서 분리된 항 세균성 단백질인 누에신을 느타리버섯에서 과발현시키고자 하였다. 누에신 cDNA는 여름 느타리버섯의 ${\beta}$-tubulin 프로모터에 결합되어 pTRura3-2 vector와 함께 우라실 영양요구성 돌연변이 균주에 형질전환되었다. 누에신 cDNA가 형질전환된 느타리버섯을 genomic PCR과 Southern blot을 통하여 분리할 수가 있었으며, 이들 중 3개의 형질전환체가 누에신 유전자를 발현시킴을 확인하였다. 그러나 이들 형질전환체들에서 누에신 단백질을 검출할 수 없었으며, 또한 항 세균 효과도 확인할 수 없었다. 이들 결과는 형질전환기술을 이용한 병 저항성 개발 가능성을 보여주고 있다.

• Current Research on Agriculture and Life Sciences
• /
• 제5권
• /
• pp.119-126
• /
• 1987

사과나무 부란병균 병반상에서 검출된 비병원성 Valsa속 균의 비병원균 인자가 부란병균으로 전이되는지의 여부를 밝히기 위해서는 적당한 유전표식(遺傳標識)이 필요하므로 두 균종(菌種)에서 영양요구성 돌연변이주를 작출(作出)하기 위해 수행한 실험결과는 다음과 같이 요약된다. 본 균의 영양요구성 돌연변이주의 검출에 가장 적합한 합성배지로는 E. Parasitica의 연구에 사용되었던 최소배지 및 완전배지가 선발되었고 단집락형성용 배지로는 이 최소배지에 0.5%의 L-sorbose를 첨가한 것이 가장 좋았다. 단집락형성용 배지상에서 포자가 발아하기까지는 약 96시간이 소요되는 것으로 밝혀져 자외선 조사후 완전배지를 중층(重層), putative auxotrophs를 선발하기 위해서는 적어도 96시간 이상 야생형(野生型)을 지속적으로 제거해야 될 것으로 나타났다. 병포자 발아과정의 핵의 행동을 추적해 본 결과, 1차 핵분열이 일어나는데 소요되는 시간은 약 60시간으로 자외선 처리 후 photoreactivation에 의한 reversion을 최소화하기 위해서는 조사(照射) 후(後) 60시간(時間) 이상 암상태(暗狀態)에 보존해야 하는 것으로 나타났다. 적절한 자외선 조사방법(照射方法)을 선정하기 위하여 병포자현탁액에 조사(照射)하는 방법과 단집락형성용 배지에 포자를 도말하고 그 위에 자외선을 조사(照射)하는 방법(方法)을 비교 검정해 보았다. 병포자현탁액에 자외선을 조사(照射)한 방법에서는 130초에서 포자의 발아능력이 완전히 상실되었고 생존율이 0.1%에서 7%의 범위인 80초~120초 사이에서 putative auxotrophs를 선발할 수 있었다. 한편, 단집락형성용 배지상에 도말된 병표자에 자외선을 조사(照射)한 방법에서는 90초의 조사(照射)에서 포자의 발아능력이 완전히 상실되었고 50초 정도의 조사(照射)에서 가장 많은 수의 putative auxotrophs를 선발할 수 있었으며, 조사(照射)시간에 따른 포자생존율에 있어서 균주간에 큰 변이가 없는 후자의 방법이 우수한 것으로 나타났다. 본 실험에서 선발한 161개의 putative auxotrophs 중 10개의 영양요구성이 확인이 되었는데 nucleic acid base 요구성 4균주, amino acid 요구성 4균주 vitamine 요구성 2균주가 얻어졌다. 이들 영양요구성 돌연변이주의 병원성을 조사한 결과, 병원성이 상실된 것이 5균주, 약병원성 3균주, 여전히 강한 병원성을 유지하고 있는 것이 2균주로 나타났는데 약병원성 또는 강병원성을 나타낸 5균주중 nicotine 요구성인 AM513만 병반상에서 포자가 내장된 병자각을 형성하였고 여타의 균주는 포자형성능(胞子形成能)이 상실되었다.

• 생명과학회지
• /
• 제21권10호
• /
• pp.1370-1376
• /
• 2011

고세균 Sulfolobus acidocaldarius의 기능유전체학 연구를 위하여 피리미딘 생합성 유전자군의 pyrEF 유전자에 근거한 피리미딘 영양요구주를 구축하였다. 원균주는 정상적인 pyrEF 존재하에서 5-fluoroorotic acid를 첨가하면 성장이 불가능하나 피리미딘 영양요구주는 성장이 가능한 원리를 활용하였다. 자외선을 이용하여 얻어진 5-FOA 첨가에 저항성을 갖는 돌연변이주를 얻었으며, 두 돌연변이주 KH1U와 KH2U는 각각 pyrE 유전자 부분의 점돌연변이와 삽입돌연변이를 갖는 돌연변이주임을 알 수 있었다. 이 두 돌연변이 균주는 5-FOA의 첨가에 의하여 이 세포를 사멸시킬 수 있는 능력이 사라짐을 확인하였다. 정상적인 pyrEF 유전자를 갖는 Sulfolobus-E. coli 플라스미드를 이용하여 보완실험을 수행한 결과 KH2U 돌연변이주는 다시 5-FOA에 대한 저항성을 잃어버렸으며, 배지내에 피리미딘의 첨가가 없어도 생존할 수 있는 능력을 보여주는 원균주와 같은 표현형으로 회귀함을 확인하였다. 이 연구는 차후 고세균 Sulfolobus acidocaldarius의 유전자 불활성화를 통한 유전학연구에 효율적인 도구로 사용되기에 유용한 연구로 생각된다.