• Applied Biological Chemistry
• /
• 제40권6호
• /
• pp.495-500
• /
• 1997

Cyclodextrin을 합성하는 효소 CGTase를 호염기성 Bacillus sp. E1으로부터 분리하기 위하여 PCR을 실시하였다. PCR을 위하여 합성한 primer의 염기서열은 현재까지 보고된 CGTase 유전자의 염기서열을 비교 분석하여 가장 높게 보존된 영역을 찾아내어 선택하였다. PCR 증폭 결과 1.2 kbp 크기의 DNA 절편을 얻을 수 있었고 이를 molecular probe로 이용하여 Southern blot 분석을 실시하였다. Southern blot 분석결과 CGTase 유전자는 염색체 DNA를 제한효소 XbaI으로 절단한 5.3 kbp 절편내에 존재한다는 사실을 알아내었다. CGTase 유전자를 분리하기 위하여 유전자 은행을 제조한 후 선별작업을 실시하여 genomic clone인 pCGTE1을 얻을 수 있었다. pCGTEl의 염기서열을 결정한 결과 분리한 CGTase 유전자는 2109 bp의 open reading frame을 가지며 이는 703개의 아미노산으로 구성된 단백질을 coding하는 것으로 나타났다. 아미노산 서열의 유사성을 비교한 결과 Bacillus sp. KC201의 CGTase 와 가장 높은 94.3% 동질성을 나타내었다.

• 환경생물
• /
• 제17권2호
• /
• pp.191-198
• /
• 1999

침엽수와 활엽수 펄프내의 리그닌(lignin) 제거 효과를 개선하기 위해 호알칼리성 균류인 Cephalospotium sp. RYM-202의 xylanase를 표백 전처리하고 이에 의한 펄프의 표백 증진 효과를 조사하였다. 두 종류의 펄프 모두 5$0^{\circ}C$에서 효소반응을 수행하였을 때 펄프내 xylan의 가수분해가 가장 높게 나타났다. 펄프내 xylan의 가수분해를 위한 효소의 최적 pH는 8.0이었으며, pH 9.0에서도 최대활성의 90%이상이 유지되었다. 각각의 펄프 재료에 효소를 전처리한 결과 표백(리그닌 제거)과정의 증진 효과를 보였으며, 침엽수와 활엽수의 kappa number는 각각 3.7과 2.0 ISO units 만큼 감소되었다. 아울러 효소처리 혹은 효소 미처리 펄프를 각각 표백한 후 수초지를 제조하여 종이의 물성을 상호 비교한 바, 효소처리는 종이의 섬유 구조에 큰 영향을 끼치지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 호알칼리성 Cephalospotium sp. RYM-202의 알칼리내성 xylanase가 알칼리 조건하에서의 펄프 전처리 과정에 매우 적합함을 의미한다.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제20권4호
• /
• pp.371-376
• /
• 1992

Bacillus sp. SH-8은 pH 9.0 이상에서 생육이 가능하였고 pH 7.7 이하에서는 배양 12시간부터 O.$D_{550}$가 급격히 감소하였으며 생균수도 감소하였다. 그러나 Bacillus sp. SH-8M은 pH7.7에서 생육이 가능하였고 pH6.9에서도 약간 생육속도가 늦었으나 정상적인 생육을 나타내었다. 고체배지의 생육 양상도 액체배지에서와 비슷한 결과를 나타내었다. 균주의 형태는 pH 10.2에서 두 균주 모두 단간균위 형태를 나타내었으나 pH7.7에서는 Bacillus sp. SH-8 균주만이 장간균의 형태를 나타내었다. 균체외 pH는 초기 10.2일 때 두 균주 모두 배양 28시간 후에는 9.0이었고 초기 pH 9.0와 9.6에서는 배양초기에 pH가 저하되었다가 12시간 후부터 상승하였다. 한편, Bacillus sp. SH-8M은 초기 pH 6.9와 7.7일때 배양시간에 따라 균체외의 pH가 8.0과 8.7로 상승하였으나 Bacillus sp. SH-8은 배양 12시간 이후에도 7.0으로 일정하였다. 포자형성능은 Bacillus sp. SH-8과 Bacillus sp. SH-8M 모두 배양 3일 후, 초기 pH 10.2일 때 각각 95%와 85%로 가장 높았다.

• 농업생명과학연구
• /
• 제45권6호
• /
• pp.201-212
• /
• 2011

인천 연안의 심하게 오염된 갯벌로부터 강력한 세포외 알카리성 단백질 분해효소를 생산하는 호알카리성 Bacillus clausii I-52를 분리하였으며, 이 균주로부터 알카리성 단백질 분해효소의 유전자를 cloning하여 서열 분석을 하였다. Chromosome 서열이 완전히 밝혀진 Bacillus subtilis의 서열을 기초로 하여 알카리성 단백질 분해효소 및 promoter를 포함하도록 primer를 고안하여 PCR을 수행하여 2,277 bp의 DNA 단편을 얻었으며 BLAST 분석 결과 29 개의 아미노산으로 이루어진 signal peptide, 77 개의 아미노산으로 이루어진 propeptide 및 275 개의 아미노산을 갖는 활성형의 BCAP으로 구성된 총 381 개의 아미노산을 코딩하는 1,143 bp의 open reading frame을 확인하였다. 활성형 BCAP의 N-말단 아미노산은 Ala이며, 분자량 및 pI 값은 각각 27698.7 Da과 6.30으로 계산되었다. 아미노산 상동성을 분석한 결과, B. subtilis 유래의 nattokinase precursor 및 B. subtilis BSn5 유래의 subtilisin E precursor와 99%의 서열 상동성을 나타내어 B. clausii I-52 유래의 BCAP은 subtilisin 계열의 단백질 분해효소임을 확인하였다. E. coli BL21(DE3)에서 발현한 재조합 BCAP는 N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 를 효율적으로 분해하였다. Refolding한 재조합 BCAP은 전형적인 serine protease inhibitor인 PMSF에 의하여 강하게 효소 활성이 억제됨으로써 serine protease 계열의 단백질 분해효소임을 알 수 있었다.

• 한국균학회지
• /
• 제50권1호
• /
• pp.65-73
• /
• 2022

본 연구는 남해안 해운대와 인근 몽돌해수욕장 주변의 야생 효모 종 분포특성을 알아보기위해 이들 지역 주변의 물과 모래, 토양 등 70점의 시료들로부터 일반 효모와 호알칼리성 균주 등 모두 37종, 41균주의 야생 효모들을 분리하였다. 이들 야생 효모들 중 Cys. insectorum HUD16-3 (JSLKSS-002)와 M. citriensis HUD12-5 (JSL-KSS-001)등 두 균주들이 국내 보고되지 않은 미기록 효모들로 선별되었고 필자 등이 전라북도 장선천 주변 토양에서 분리하여 국내 미기록 균주로 선별한 Cys. lysinophilum JSC 52-2 (JSL-GGU-019)와 대전광역시 장태산 호수 주변에서 분리하여 선별한 C. takata NMD11-1 (JSL-GGU-017), C. panamensis ASG58M-2 (JSL-GGU-018)등 5종의 미기록 야생 효모들의 균학적 특성을 조사하였다. 이들 미기록 효모들은 모두 난형으로 출아에 의해 영양 증식을 하였고 포자와의 균사를 형성하지 않았다. 미기록 효모 모두 vitamin-free배지에서도 생육하였고 M. citriensis HUD12-5균주는 50% 포도당을 함유한 YPD배지에서 생육하는 강한 내당성을 보였고 Cys. insectorum HUD16-3과 M. citriensis HUD12-5균주들은 15% NaCl을 함유한 YPD배지에서도 생육이 비교적 양호한 호염성균이었다 또한, 미기록 효모들 모두 포도당과 fructose, sucrose, 전분 등을 자화시켰고 특히Cys. lysinophilum JSC 52-2등 3균주들은 lactose를 자화시켰다.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제20권5호
• /
• pp.519-526
• /
• 1992

Bacillus pasteurii의 urease gene이 Escherichia coli HB101에서 발현된 Bacillus성 recombinant urease를 단일단백질으로 정제하고 그 효소학적 특성을, 별도로 정제한 B.pasteurii urease의 그것과 비교검토하였다. B.pasteurii urease gene이 cloning 된 E.coli HB101(pBU11)의 균체파쇄액으로 부터 TEAE-cellulose, DEAE-Sephadex A-50, Sephadex G-150, sephadex G-200 등의 이온교환 크로마토그래피와 gel filtration을 이용하여 E.coli내에서 발현된 B. pasteurii성제하였으며, 또한 B.pasteurii로부타 비활성도 185.2배의 urease를 정제하여 disc gel electrophoresis로 단일 단백으로 정제되었음을 확인하였다. 정제된 두 urease 들의 native 상태의 분자량은 공히 280,000$pm$10,000 정도로 확인되었고, SDS-electrophoresis에의 해 subunit 유무와 분자량을 확인한 결과도 67,000정도의 subunit 4개와 20,000의 subunit 1개로 된 $\alpha$$\beta$ 구조의 동일한 효소단백으로 추정할 수 있었다. Gene donor인 B. pasteurii와 cloning 된 균주 E. coli(pBU11)이 생산한 두 urease의 효소학적 특성을 비교 조사해본 결과 두 urease의 최적반응 pH는 공히 7.5로 나타났으며, pH에 대한 안정성도 두 ureaserk 공히 pH 5.5에서 10.5 사이에서 50% 이하로 활성이 떨어지지 않는 강한 pH 안정성을 보였다. 두 urese의 최적반응의 온도는 $60^{\circ}C$였으며, 비교적 온도에 대한 저항이 강한 효소임을 알았다. 두 urease의 활성에 미치는 금속이온의 영향은 $Ag^{2+}$, $Hg^{2+}$ 등에서 양효소가 모두 강한 저해현상을 받는 반면, $Mn^{2+}$, $Mg^{2+}$ 에서는 다소 촉진되는 현상을 보였다. 효소반응 저해제들의 영향을 조사해 본 결과 p-CMB, acetohydroxamic acid에 두 urease가 모두 강한 저해를 받았다. 두 urease의 $K_m$ 값과 $V_{max}$ 값은 E. coli(pBU11)의 urease는 $4.21{\times}10^{-2}mol/\ell$, $86.96\ell$mol/min 이었고, B. pasteurii urease는 $4.04{\times}10^{-2}mol/\ell$, $160\ell$mol/min이었다. 따라서 B. pasteurii의 urease나 그 urease gene으로 cloning되어 E. coliso에서 발현된 recombinant urease는 분자량이나 효소학적 특서에서 거의 동일한 효소단백임을 알 수 있었다.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제26권2호
• /
• pp.122-129
• /
• 1998

최근 생물방제균으로 주목받고 있는 Enterobacter cloacae의 방제기작이 이 균에 의해 토양내에서 생산된 휘발성 ammonia이며 ammonia의 생산에는urease가 관계한다는 보고를 근거로 하여, 항생물질 생산성 균주로 선발된 우수한 길항균주에 암모니아 생성능, 즉 urease 유전자를 유전적으로 부가함으로써 항진균성 길항물질 생산과 암모니아 생산이 동시에 이루어 질 수 있는 새로운 다기능의 생물방제균을 유전적으로 육종하고자 하였다. 저병해 인삼경작지로부터 식물근부균 Fusarium solani의 생육을 강하게 억제하는 길항세균 한 균주 SH14균주를 분리, 선발하였으며, 분리된 균주를 동정한 결과 Bacillus subtilis이거나 그 근연종으로 추정되었다. 억제기작 실험을 통해 길항균주 B. subtilis SH14에 의해 생산되는 항진균성 길항물질은 외막가수분해효소와 같은 고분자 물질이 아니라 열에 안정한 저분자의 항생물질임을 알 수 있었다. 한편 ammonia 생산을 위한 urease의 유전자는 urease 생산력이 강력한 호알칼리성 Bacillus pasteurii의 urease 생산유전자를 E. coli-Bacillus shuttle vector인 pEB203에 subcloning하였고, 이어서 pGU 366으로 명명된 이 recombinant plasmid를 선발된 항진균성 길항균주 B. subtilis SH14에 PEG-induced protoplast transformation 방법으로 도입, 발현시켰으며, 최적조건을 조사하여 90분간의 lysozyme 처리과정 후 1.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$의 DNA와 40% PEG4000의 첨가로 약 6.5$\times$$10^{-4}$의 형질전환율을 얻을 수 있었다. 아울러 암모니아 생성능이 부가된 생물방제균 B. subtilis SH14(pGU366)에 의해 식물근부균 F. solani에 대한 생육억제력이 증가되는지 여부를 억제거리 측정법과 균체중량법을 통해 확인한 결과 urease 유전자가 도입된 형질전환체 B. subtilis SH14(pGU366)의 근부균 생육억제능이 각각 36.7%, 44.0%정도로 숙주균주인 B. subtilis SH14에 비해 근부균 생육억제능을 보다 강하게 나타내었음을 알 수 있었다. 따라서 항진균성 항생물질 생산성 생물방제균 B. subtilis SH14에 외부의 urease유전자를 도입하여 ammonia 생성능을 부가함으로써 생물방제력의 상승효과를 거둘 수 있었다.