Production of green fluorescent protein (GFP) as a model foreign protein using different culture scales under co-expression of Vitreoscilla hemoglobin (VHb) in the industrial Escherichia coli strain W3110 (a K12 derivative), was examined. It was found that the VHb co-expressing W3110, exhibited an exceptional and sustained production ability during cell cultures using different scales, while the VHb non-expressing strain showed variable production levels. This high and sustained production ability indicates that the VHb co-expressing E. coli W3110, could be successfully employed for practical large-scale production cultures without the need for serious consideration of scale-up problems.
The aerobic growth and metabolic performance of Escherichia coli strains BL21 and W3110 were studied when the Vitreoscilla hemoglobin (VHb) was constitutively expressed in the chromosome. When VHb was expressed, acetate production decreased in both strains and was nearly eliminated in BL21. Transcriptional levels of the glyoxylate shunt genes decreased in both strains when VHb was expressed. However, higher transcription of the α-ketoglutarate dehydrogenase genes were observed for W3110, while for BL21 transcription levels decreased. VHb expression reduced the transcription of the cytochrome bo3 genes only in BL21. These results are useful for better selecting a production host.
한약재 중에서 항균성 물질을 찾고자하는 연구의 일환으로 실험균의 생육에 대한 항생제와 보존료의 영향을 조사하였고, 각종 한약재 물추출물의 항균성을 조사하였다. 오미자 물추출물은 모든 실험균에 대하여 공통적으로 생장 저해를 나타내었다. 오미자 추출물의 농도별 항세균능을 살펴본 결과, 0.2%이상 첨가할 경우 시간의 경과에 따른 Escherichia coli W3110과 Enterobactey cloacae MG82 및 Salmonella typhimurium의 증식을 크게 억제할 수 있었다. 오미자 추출물을 첨가하지 않은 대조구에 있어서 Escherichia coli W3110의 평균 비증식 생장속도는 0.514 (hr ̄)이었고, Enterobacter cloacae MG82는 0.381(hr ̄)이었고, Salmonella typhimurium은 0.489(hr ̄)이었다. 오미자 추출물을 0.2% 첨가할 경우 Escherichia coli W3110과 Enterobacter cloacae MG82 및 Salmonella typhimurium의 평균 비증식 생장속도는 대조구에 비해 각각 1.26배, 2.23배, 1.50배 감소하였으며, 최소 저해 농도는 0.25%로 강한 항균활성을 보였다. 오미자 추출물은 Enterobacter cloacae MG82에 대해 가장 큰 증식 저해효과를 나타내었다.
Expression of the vhb gene encoding bacterial hemoglobin (VHb) from Vitreoscilla has been used to improve recombinant cell growth and enhance product formation under microaerobic conditions because of its ability to enhance oxygen use. We coexpressed GFP and VHb in Escherichia coli BL21 and W3110, and compared with GFP control which was not expressed VHb. We used nar oxygen-dependent inducible promoter for VHb expression. The GFP amounts in E. coli expressed VHb was about five fold higher than in the control Fluorescence intensity was increased about two fold.
We investigated the association of Chlorella vulgaris and E. coli W9110 in removal of total organic carbon with the lab-scaled continuous river water flow system (CRWFS). Artificial wastewater was applied at two levels of organic carbon concentration; 1,335 $mg{\cdot}l^{-1}$ in the treatment (T)-1 and 267 $mg{\cdot}l^{-1}$ in T-2. The highest densities of C. vulgaris were $8.3{\times10^6\;cells{\cdot}ml^{-1}$ in T-1 and $6.9{\times}10^6\;cells{\cdot}ml^{-1}$ in T-2. The maximum densities of E. coli W3110 were $2.0{\times}10^8$ clony forming unit (CFU)${\cdot}ml^{-1}$ in T-1 and $3.9{\times}10^8\;CFU{\cdot}ml^{-1}$ in T-2. The densities increased during the first 11 days in T-q and 4 days in T-2, and decreased rapidly till 35th day, then increased slightly afterwards. This trend was prominent in T-2. It was inplied that wider range of nutrients was required in the growth of heterotrophic bacteria in T-2 than in T-1. The algal biomass should be increased effectively for the successful removal of organic carbon.
To find alternative genetic resources for D-serine dehydratase (E.C. 4.3.1.18, dsdA) mediating the deamination of D-serine into pyruvate, metagenomic libraries were screened. The chromosomal dsdA gene of a wild-type Escherichia coli W3110 strain was disrupted by inserting the tetracycline resistance gene (tet), using double-crossover, for use as a screening host. The W3110 dsdA::tet strain was not able to grow in a medium containing D-serine as a sole carbon source, whereas wild-type W3110 and the complement W3110 dsdA::tet strain containing a dsdA-expression plasmid were able to grow. After introducing metagenome libraries into the screening host, a strain containing a 40-kb DNA fragment obtained from the metagenomic souce derived from a compost was selected based on its capability to grow on the agar plate containing D-serine as a sole carbon source. For identification of the genetic resource responsible for the D-serine degrading capability, transposon-${\mu}$ was randomly inserted into the 40-kb metagenome. Two strains that had lost their D-serine degrading ability were negatively selected, and the two 6-kb contigs responsible for the D-serine degrading capability were sequenced and deposited (GenBank code: HQ829474.1 and HQ829475.1). Therefore, new alternative genetic resources for D-serine dehydratase was found from the metagenomic resource, and the corresponding ORFs are discussed.
It was examined carefully that the bacterial die-off between Chlorella vulgaris and E. coli. W3110 was tested through adding TOC (total organic carbon) with the lab-scaled continuous river water flow system (CRWFS). Artificial synthetic wastewater was applied at two levels of organic carbon concentration; 1,335 mg/l in treatment type 1 and 267 mg/l in type 2. In both types, the population densities of Chlorella vulgaris were similar in a maximum 8.25 ${\times}$ 10$\^$6/ cells/ml (type 1) and 6.925 ${\times}$ 10$\^$6/ cells/ml (type 2). The maximum densities of E. coli. W3110 were 2.0 ${\times}$ 10$\^$8/ colony forming unit (CFU)/ml in type 1 and 3.9 ${\times}$ 10$\^$8/ CFU/ml in type 2. The densities increased for 11 days in type 1 and 4 days in type 2, then decreased rapidly till the 35th day, then slightly increased again. This trend was prominent in type 2. It implied that a wider range of nutrients was required in the growth of heterotrophic bacteria in type 2 than in type 1. We could not expect successful bacterial die-off if the wastewater retention time was not furnished sufficiently.
대장균 W3110으로부터 NTG 및 UV를 사용하여 여러 단계의 돌연변이 실험을 거치면서 스레오닌 고생산균주인 대장균 TF427를 선별하였다. 선별된 변이주는 스레오닌 유사체인 AHV 내성, 메치오닌 및 이소루이신 요구성을 특징으로 한다. 5-L 발효조 실험에서 44시간 발효하였을 때 46.5g/l의 스레오닌이 생산되었다. 효모분석에 의하면, TF427의 아스파토키나아제 I의 활성은 스레오닌에 의해 저해받지 않았으며, 이 효소의 합성은 스레오닌과 이소루이신에 의해 억제를 받지 않았다.
Overexpression of the genes encoding phosphoeneolpyruvate carboxykinase (pckA) and NAD-dependent malic enzyme (maeA) facilitates higher intracellular ATP and NAD(P)H concentrations, respectively, under aerobic conditions in Escherichia coli. To verify a hypothesis that higher intracellular energy reserves might contribute to H2 fermentation, wild-type E. coli strains overexpressing pckA and maeA were cultured under anaerobic conditions in a glucose minimal medium. Overexpression of pckA and maeA enabled E. coli to produce 3-times and 4-times greater H2 (193 and 284 nmol, respectively) than the wild type (66 nmol H2). The pckA and maeA genes were further overexpressed in a hydrogenase-3-enhanced E. coli strain. The hydrogenase-3-enhanced strain (W3110+fhlA) produced 322 nmol H2, whereas the ATP-enhanced strain (W3110+fhlA+pckA) produced 50% increased H2 (443 nmol). Total H2 in the NAD(P)H-enhanced strain (W3110+fhlA+maeA) was similar to that in the control strain at 319 nmol H2. Possible explanations for the contribution of the increased cellular energy reserves to the enhanced hydrogen fermentation observed are discussed based on the viewpoint of metabolic engineering strategy.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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