• BMB Reports
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• 제39권1호
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• pp.61-67
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• 2006

Molecular co-suppression phenomena are important to consider in transgene experiments. Embryogenic cells were obtained from immature cotyledons and engineered with two different gene constructs (pHV and pHVS) through particle bombardment. Both constructs contain a gene conferring resistance to hygromycin (hpt) as a selective marker and a modified glycinin (11S globulin) gene (V3-1) as a target. sGFP(S65T) as a reporter gene was, however, inserted into the flanking region of the V3-1 gene (pHVS). Fluorescence microscopic screening after the selection of hygromycin, identified clearly the expression of sGFP(S65T) in the transformed soybean embryos bombarded with the pHVS construct. Stable integration of the transgenes was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and Southern blot analysis. Seeds of transgenic plants obtained from the pHV construct frequently lacked an accumulation of endogenous glycinin, which is encoded by homologous genes to the target gene V3-1. Most of the transgenic plants expressing sGFP(S65T) showed highly accumulation of glycinin. The expression of sGFP(S65T) and V3-1 inherits into the next generations. sGFP(S65T) as a reporter gene may be useful to increase the transformation efficiency of transgenic soybean with avoiding gene co-suppression.

• 원예과학기술지
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• 제29권4호
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• pp.345-351
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• 2011

원예작물의 내병성 육종에 있어 $F_2$와 그 이후 분리 세대에서 유용하게 사용할 수 있는 선발방법의 모델 시스템을 개발하고자 하였다. 상용 토마토 품종인 '모모따로 요크'에 제초제 저항성 유전자를 도입한 후 획득된 형질전환체의 도입 유전자 수와 후대 분리비를 분석하고, 제초제 저항성 유전자와 기존 병 저항성 유전자가 연관된 개체를 선발하였다. 총 60개의 형질전환체 중에서 42개체에 Southern blot을 실시하여 도입 유전자 수를 확인하고, 제초제 저항성 유전자에 대한 분리비를 비교 분석하여 Southern 결과와 도입된 유전자의 표현형의 분리비가 일치하지 않으며 여러 개의 copy가 삽입된 대부분의 경우, 실제 도입된 copy 수보다 더 적은 copy 수를 가지는 것처럼 분리비를 나타내는 것을 알 수 있었다. 삽입된 제초제 저항성 유전자와 기존 병 저항성 유전자가 가깝게 연관된 개체를 찾기 위해 $T_1(F_2)$세대 개체에 대하여 two-stepwise screening 방법을 실시하여 위조병 저항성 I2 유전자(11번 염색체)와 제초제 저항성 patII 유전자가 대략 12-13cM으로 가깝게 연관된 개체(T-20)를 선발하였다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제41권4호
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• pp.216-222
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• 2014

본 연구는 팔레놉시스의 원괴체유사체를 재료로 효율적인 형질전환 체계를 확립하기 위해 수행되었다. 이를 위해 PPT 제초제에 저항성을 가지는 bar 선발유전자와 노화지연 형질을 보이는 ORE 7 유전자를 함유하는 pCAMBIA 3301:ORE7 벡터를 이용하여 유전자총 형질전환 시 발사횟수 증가 그리고 유전자총 실험 전후에 삼투압조절제 처리를 하여 실험목적을 달성하고자 하였다. 실험결과, 2회 발사처리가 1회나 3회 발사횟수와 비교하여 1.5 ~ 2.5배 이상의 형질전환 효율을 보여 주었으나, 신초 재분화율이 낮고 갈변율은 높은 현상을 보여 주었다. 다양한 삼투압 조절제 처리에 의한 형질전환효율 향상 실험에선 0.2 M mannitol과 0.2 M sorbitol 이 2가지 조절제 혼합처리가 단용처리나 무처리구에 비해 형질전환 효율과 신초재 분화율에서 최소 1.5 ~ 3배 이상의 효율을 보여 주었고, 갈변율도 2배 이상 낮게 나타났다. PCR 분석을 통하여 bar 유전자와 ORE7 유전자가 도입되었음을 확인하였고, 임의로 선발한 형질전환 팔레놉시스 21개체를 대상으로 real-time PCR 분석을 통해 4개체가 1 copy의 목적유전자를 가지고 있으며, 나머지 17 개체들은 2 copy 이상의 유전자를 보유하고 있음이 밝혀졌다. 본 연구에서 생산된 형질전환 팔레놉시스 개체들은 순화과정을 거쳐 화분으로 이식하여 생육과정을 거쳐 꽃이나 잎에 변이가 없는 개화과정을 보여 주었다.

• 한국가축번식학회지
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• 제19권1호
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• pp.35-41
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• 1995

본 연구는 형질전화우의 생산성 제고를 위한 일환으로서 새로운 기법인 retrovirus vector system의 이용성을 검토하고자 실시하였다. Retrovirus-producing cell은 미세주입법을 이용하여 체외생산된 1.5일(1~4-세포기) 수정란의 위란강에 주입(5~10 cells/embryo) 되었으며, 이때 사용된 retrovirus-producing cell line은 Gibbon ape leukemia virus (GaLV) envelope protein에 encapsidation되어 replication-defective retrovirus를 분비하도록 제작되었다. 주입된 유전자의 표지유전자로서 E. coli LacZ 유전자를 사용하였으며, X-gal 염색법은 발달이 유도된 상실배와 배반포 단계에 실시하여 LacZ 유전자의 발현 유무를 확인하였다. 이 실험의 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. Virus의 infectivity를 높이기 위해 사용된 polybrene의 최저농도는 5$\mu\textrm{g}$/ml이었다. 2. Retrovirus-producing cell이 주입된 1.5일 수정란의 상실배기와 배반포기로의 발달율은 29%였다. 3. 이 때의 LacZ+ 발현율은 21%였다. 4. 본 실험에 사용된 retrovirus-producing cell은 replication-competent retroviruses를 생산해 내지않는다는 것을 확인할 수 있었다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2000년도 국제심포지움
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• pp.7-8
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• 2000

Transgenic animals are very useful for scientific, pharmaceutical, and agricultural purposes. In livestock, transgenic technology has been used forthe genetic alteration of farm animals, the production of human proteins inlarge quantities in the milk of transgenic farm animals, and the generation of animals with organs suitable for xenotransplantation. To date, the transfer of foreign genes into farm animals has been performed mainly by microinjection of DNA into the pronuclei of fertilized eggs. However, the overall success rate of transgenic animals in livestock so far has been disappointingly low, eg., the efficiency is 0∼5% in swine, and less than 1% in sheep and cattle, compared with the rate in mice where 5% microinjected develop into transgenic animals. Recently, McGreath et al. (2000) have succeeded in producing the gene targeted sheep by the use of nuclear transfer from cultured somatic cells transfected with a foreign gene in vitro. However, we may need plenty of time until currently employ this method for gene transfer to farm animals. We have been studying to exploit the method for improving production efficiencies of transgenic animals with emphasis of its application to farm animals. The present paper describes three approaches that we have made in our laboratory to improve production efficiencies of transgenic animals, based on the DNA microinjection method. 1. Co-injection of restriction enzyme with foreign DNA into the pronucleus for elevating production efficiencies of transgenic animals. 2. Efficient selection of transgenic mouse embryos using EGFP as a marker gene. 3. Phenotypes of tansgenic mice expressing WAP/hGH-CAG/EGFP fusion gene produced by selecting transgenic embryos. 4. Efficient site-specific integration of the transgene targeting an endogenous lox like site in early mouse embryos.

• 한국가축번식학회지
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• 제27권1호
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• pp.15-23
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• 2003

본 연구는 VSV-G glycoprotein을 envelope으로 하는 pseudotyped retrovirus vector system을 이용하여 쥐의 유방상피세포인 HC11에서 human Lactadherin 유전자의 발현을 확인하고자 하였다. 실험에 사용한 vector는 개체내에서의 외래 유전자의 지속적인 발현에 의한 생리적인 부작용을 최소화하기 위한 구조로, 조직특이적이며 lactogenic hormone에 의해 유도적인 활성을 가지는 것으로 알려진 WAP promoter의 통제하에 도입하고자 하는 외래 유전자를 위치하도록 하였다. WAP promoter의 대조군으로 지속적인 활성을 나타내는 $\beta$-actin promoter를 사용하였으며, 이 각각의 promoter와 marker gene으로 E. coli LacZ gene을 재조합한 후 retrovirus vector system을 이용하여 HCll에 도입하였다. 세포의 genome 내로의 유전자의 전이는 PCR을 통해 확인하였고, RT-PCR의 수행으로 유전자의 발현을 확인하였다. Lactadherin 유전자를 이용한 실험도 동일한 과정으로 수행하였으며, RT-PCR의 결과에서 HCll 세포에서 Lactadherin 유전자의 발현이 insulin을 단독으로 처리한 군에 비해 insulin, hydrocortisone, prolactin을 동시에 처리한 군에서 우월하게 나타나는 것으로 확인되었다. 그러나 insulin 단독 처리군에서 유전자의 발현이 약하게 나타나는 것으로 관찰되어 WAP promoter의 leakiness에 대한 재고의 필요성이 요구되었다.

• BMB Reports
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• 제38권1호
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• pp.41-48
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• 2005

In this study we developed the transposon-mediated shuttle vector 'Hanpvid', which composed of HaNPV (Heliothis armigera nuclear polyhedrosis virus) genomic DNA and a transposon cassette from Bacmid of Bac-to-Bac system. Hanpvid replicates in E. coli in the same way as Bacmid and retains infective function in cotton bollworm cells (Hz-AM1). Using Hanpvid we constructed a recombinant virus, which could infect Hz-AM1 cells and generate recombinant HaNPV (rHa-Bar) containing the barnase gene, a ribonuclease gene from Bacillus amyloliquefaciens. Since the expression vector carrying barnase gene cannot replicate in the absence of barstar, a specific inhibitor of barnase, we constructed a new cotton bollworm cell line (AM1-NB) using the marker rescue method. In AM1-NB barstar was integrated into the cellular chromosome to sustain the replication of rHa-Bar. To screen out recombinant HaNPV for potential use as biopesticide, Hz-AM1 and AM1-NB cell lines were infected with rHa-Bar, respectively. The results obtained indicate that Viral progenies in AM1-NB were 23 and 160 times greater than those in Hz-AM1 48 h and 72 h after infection, respectively. With additional insertion of the polyhedron gene from AcNPV (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) into the Hanpvid genome, rHa-Bar regained the polyhedron phenotype and its pest-killing rate greatly improved. Toxic analysis showed that the lethal dosages ($LD_{50}$) and the lethal time(s) ($LT_{50}$) of rHa-Bar were reduced by 20% and 30%, respectively, compared to wt-HaNPV in the third instar larvae of cotton bollworm. This study shows that in AM1-NB barnase can be effectively produced and used as pest-killing agent for the biological control of cotton pests.

• 한국수정란이식학회지
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• 제15권2호
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• pp.157-165
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• 2000

The efficiency of transgenic livestock production could be improved by early screening of transgene-integration and sexing of embryos at preimplantational stages before trasferring them into recipients. We examined the effciency of multiplex PCR analysis for the simultaneous confirmation of the trasgene and sex during the preimplantational development of bovine embryos and the possibility of green fluorescent protein(GFP) gene as a non-invasive marker for the early screening of transgenic embryos. The GFP gene was microinjected into the male pronuclei of bovine zygotes produced in vitro. The injected zygotes were co-cultured in TCM-199 containing 10% FCS with boving oviductal epithelial cells in a 5% CO2 incubator. Seventeen(13.0%) out of 136 gene-injected bovine zygotes developed by multiplex PCR analysis and the expression of GFP was detected by observing green fluorescence in embryos under a fluorescent microscope. Eight(67%) of 12 embryos at 2-cell to blastocyst stage were positive in the PCR analysis, but only two(11.8%) of 17 blastocysts expressed the GFP gene. Their sex was determined as 7 female and 5 male embryos by the PCR analysis. The results indicate that the screening of GFP gene and sex in bovine embryos by PCR analysis and fluorescence detection could be a promisible method for the preselection of transgenic embryos.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권2호
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• pp.171-180
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• 2001

형질전환 가금의 생산에 있어서 retrovirus vector를 이용하는 방법은 다양한 종류의 표적세포에 대하여 retrovirus 고유의 감염성에 의한 외래 유전자의 전이가 용이하고, 전이된 유전자가 진정염색질 영역 내로 선택적으로 도입될 수 있으며 유전적으로 안정성을 나타내므로 매우 효과적인 방법이다. 그러나 가금에서는 초기 배발달에 의한 급격한 세포의 수적 증가로 인해 고감염성의 virus의 획득이 요구되므로, 이를 위하여 virus stock의 농축에 있어 보다 안정적이고 pantropic인 vesicular stomatitis virus (VSV G) glycoprotein를 envelope로 가지는 pseudotyped retrovirus vector system을 이용하였으며, marker gene으로 eGFP gene이 발현되는 retrovirus를 생산하였다. 이 virus를 이용하여 여러 가지 표적세포와 primary culture한 CEF세포를 감염시켜 GFP의 발현을 확인하였으며, 농축한 virus stock은 stage X의 계란을 선택하여 windowed egg를 제작한 후 배하층에 주입하였다. 형질전환 닭은 정상 발생한 닭에 비하여 저조한 발생율을 보였으나 PCR을 이용하여 외래 유전자의 도입을 확인한 결과 100%인 것으로 나타났다. 또한 한 개체 내에서 유전자의 도입이 폐, 간, 정소, 소장 등의 여러 장기에서 확인되었다.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제27권11호
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• pp.1644-1651
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• 2014

Transgenic animals have become important tools for the production of therapeutic proteins in the domestic animal. Production efficiencies of transgenic animals by conventional methods as microinjection and retrovirus vector methods are low, and the foreign gene expression levels are also low because of their random integration in the host genome. In this study, we investigated the homologous recombination on the porcine ${\beta}$-casein gene locus using a knock-in vector for the ${\beta}$-casein gene locus. We developed the knock-in vector on the porcine ${\beta}$-casein gene locus and isolated knock-in fibroblast for nuclear transfer. The knock-in vector consisted of the neomycin resistance gene (neo) as a positive selectable marker gene, diphtheria toxin-A gene as negative selection marker, and 5' arm and 3' arm from the porcine ${\beta}$-casein gene. The secretion of enhanced green fluorescent protein (EGFP) was more easily detected in the cell culture media than it was by western blot analysis of cell extract of the HC11 mouse mammary epithelial cells transfected with EGFP knock-in vector. These results indicated that a knock-in system using ${\beta}$-casein gene induced high expression of transgene by the gene regulatory sequence of endogenous ${\beta}$-casein gene. These fibroblasts may be used to produce transgenic pigs for the production of therapeutic proteins via the mammary glands.