본 연구에서는 환경친화적인 무공해생물농약 재발을 위하여 곤충병원성 선충의 in vitro 배양방법을 개별하였다. 곤충병원선 층연 Steinernem$\alpha$ glasen 종으로부터 공생박테리아를 분리하여 동정한 결과 Xenorhabdus nem$\alpha$tophllus 종임을 확인하였으며, X enorhabdus nematophilus는 감염단계 선충의 장내에서와 in vitro 배양 동안에 그 생화학적 특성이에서 차이를 보이는 동 질형화 헨상을 나타냄을 확인하였다. 균주의 최적바지 조성은 5% yeast extract, 0.5% NaCl, $K_2HPO_4$, $0.02% MgSO_4$.$7H_2O$이였으며, $28^{\circ}C$가 최적배양 온도였다, 초기 pH 6-7에 관계 없이 성장이 진행됨에 따라서 약 90까지 층가하였다. Flask 배양에 비해서 fennentortor양에서 균주의 성장속도가 1.4배 빠르게 나타났으나, 그에 따른 상변회도 빠르게 진행되었다. 한편 Steinem$\xi$ma glaseri익 in vitro 배양을 위 힌 인공배지원으로 chIcken offal, dog food, peanut 퉁이 사용될 수 있으며 최적의 배지는 농축펀 bovine liver로 조사되었으며, 그 농도논 80%일 때 가장 높은 증식을 보였다. 또한 곤충병원선충으로부터 분리된 공생박테리아를 이용한 혼합배양방법은 공생박테리아를 사용하지 않는 경우보다 선충의 in vitro 증식속도가 2 배 가량 빨랐으며, 15일만에 약 $5.5\times10^4$/mL 의 선충이 수확되였다.
곤충병원성 선충의 이용 효율을 높이기 위하여 곤충병원성 선충 상호간 또는 선충과 곤충병원성 곰팡이와의 상호관계를 알아보았다. Steinernema glaseri는 기주의 무게에 따라 성충수에서는 차이가 없었으나 침입태 유충수에서는 차이가 있었다. 선충의 접종 농도에 따른 침입 발육된 성충수는 기주당 20마리 이하의 접종에서는 차이를 보였으나 40마리 이상 1,000마리 접종구에서는 차이가 없었고, 증식된 유충수도 기주당 1,000마리 접종구에서 현저히 적은 것을 제외하고는 차이가 없었다. 동일 기주에서의 선충 상호간 관계에서는 steinernematid 선충에 의한 기주 치사율이 heterorhabditid 선충에 의한 것보다 높았다. 즉, 서로 다른 종의 곤충병원성 선충을 동일 기주에 접종하였을 때, S. carpocapsae 포천에 의한 기주 치사율은 $76.2\pm$4.8%였고 Heterorhabditis bacteriophora 함양에 의한 치사율은 $23.8\pm$4.8%였다. 또한 S. carpocapsae 포천에 의한 기주치사율이 각각 $90.5\pm$4.8%와 $80.9\pm$4.8%, H. bacteriophora NC 1에 의한 것은 9.5$\pm$4.8%였다. S. glaseri NC와 H. bacteriophora 함양 및 H. bacteriophora NC 1을 동시 접종하였을 때는 S. glaseri NC에 의한 것이 각각 $61.9\pm$9.65%와 $80.9\pm$4.8%, H. bacteriophora 함양에 의한 것이 $38.1\pm$9.5%, H. bacteriophora NC 1에 의한 것이 $19.1\pm$4.8%였다. 그러나 두 선충의 동시 감염은 관찰되지 않았다. 그리고 S. carpocapsae All과 곤충병원성 곰팡이인 Beauveria brongniartii를 동시 또는 곰팡이를 먼저 처리했을 때는 곰팡이 12시간 전 처리부터 선충과 곰팡이의 동시 감염이 관찰되었고, H. bacteriophora NC 1는 곰팡이 6시간 전 처리부터 동시 감염이 관찰되었다. 선충에 의한 감염과, 곰팡이에 의한 감염, 선충과 곰팡이 동시 감염은 곰팡이 48시간 전 처리부터 관찰되었다. 그러나 유충 증식수는 선충 단독 감염보다 동시 감염충에서 현저히 떨어졌다.
A survey for entomopathogenic nematodes was conducted throughout the nine provinvrd and within three city limits during the summer of 1990 and 1991. Six of the nine provinces and one of the three cities were positive for entomopathogenic nematodes. Out of the total 499 soil samples, 23(4.6%) were positive for entomopathogenic nematodes with 19(3.8%) containing Steinernema and 4(0.8%) containing Heterorhabditis. Heterorhabditis bacteriopora and three distinct groups of Steinernema species were idintified. One groups was indentified as S. carpocapsae, another S. glaseri and the other S. monticola based on cross breeding studies. Positive sample sites in each habitat includes 15 of the 415(3.6%) from forests including regrowth areas with shrubs, 1 of the 27(3.7%) from turfgrass including golf courses and parks, 3 of the 24(12.5%) from agricultural fields, 2 of the 16(12.5%) along riparian areas, and of the 17(11.8%) near the seashore. We advocate that more surveys be conducted for entomopathogenic nematodes before commercial sources of nematodes are widely applied which may obscure the naturally-occurring nematodes. A key to Steinernema is provided for the identification.
한국산 곤충병원성 선충 S. carpocapsae GSN1 계통(ScG), S. glaseri Dongrae 계통(SgD), Heterorhabditis bacteriophora Hamyang 계통(HbH) 및 Heterorhabditis spp. Cyeongsan 계통(HeG)에 대한 알팔파바구미의 감수성을 실내 페트리디쉬 검정하였다. 알팔파바구미의 유충 치사율은 선충 종과 처리농도에 따라 유의적인 차이가 있었다. 알팔파바구니의 유충 한 마리당 각 선충 계통의 감염충(3령충)을 20마리 이상 접종했을 때 3일 후 77.5(HbH)-100(SgD)의 높은 치사율을 나타내었다. 선충의 침입수는 선충 종과 처리농도에 따라 차이가 있었으나, 증식수는 유의적 인 차이가 없었다. 침 입수에서는 SgD를 알팔파바구미 유충 한 마리당 80마리로 접종했을 때 30.2마리로 가장 많았다. 그리고 증식수는 HeG를 알팔파바구미 유충 한 마리당 80마리로 접종했을 때 2,671.5로 가장 많았다. 한국산 곤충병원성 선충 4 계통은 알팔파바구미의 성충에는 전혀 기생하지 않았으나 노숙 유충에 대해서는 매우 감수성이었다.
홍가슴루리잎벌(Arge captiva)과 장미등애잎벌(A. pagana pagana), 극동등애잎벌(A. similis)의 환경친화적 방제를 위하여 곤충병원성 선충(Heterorhabditis sp. 경산 계통, Steinernema carpocapsae GSN1 계통, S. feltiae Monteri 계통, S. glaseri 동래 계통, S. longicaudum 논산 계통, S. monticolum 지리 계통)을 이용하여 실내와 포트에서 실험을 수행하였다. 홍가슴루리잎벌 3령충에 대한 곤충병원성 선충의 병원성은 S. carpocapsae GSN1 계통과 S. feltiae Monteri 계통 처리 시, 처리 5일 후 100%의 치사율을 보였다. 홍가슴루리잎벌레 3령충에 침입한 선충의 수는 S. glaseri 동래 계통의 경우 10.2마리였으며 S. carpocapsae GSN1 계통은 4.2마리였다. 장미등애잎벌의 령기별에 따른 S. carpocapsae GSN1 계통의 병원성은 노숙화 될수록 높아 2령충과 3령충, 4령충에 대한 반수치사농도($LC_{50}$)는 각각 11.5, 9.3, 8.4 마리였다. Pot 실험에서 S. carpocapsae GSN1 계통을 $2{\times}10^9$마리/ha 농도로 처리 시, 홍가슴루리잎벌과 장미등애잎벌, 극동등애잎벌의 보정사충율은 각각 72.5, 85.0, 85.0%를 나타내었다.
느타리버섯 재배사에서 버섯혹파리(Mycophila speyeri)에 대한 한국산 곤충병원성 선충 Steinernema carpocapsae 포천 계통, S. logicaudum 논산 계통, S. glaseri 동래 계통, Heterorhabditis bacteriophora 함양 계통과 Heterorabditis sp. 경산 계통의 방제효과를 평가하였다. 5종의 한국산곤충병원성 선충 중 버섯혹파리에 대한 방제는 steinernema 속 3종보다 Heterorhabditis 속 2종의 효과가 높았다. 방제효과가 가장 높았던 종은 H. bacteriophora 함양 계통이었으며, $1.5 m^2$ 당 $1\times10^6$ 마리로 처리한 7일, 14일, 21일째 방제효과는 창녕에서 $49.0\%,\;89.5\%,\;89.1\%$였고, $1\times10^5$마리로 처리했을 때는 $46.5\%,\;76.7\%,\;85.4\%$였다. 그리고 진주에서는 $1\times10^6$마리로 처리한 7일, 14일, 21일째 방제효과가 $54.0\%,\;74.5\%,\;79.8\%$였으며, $1\times10^5$마리로 처리했을 때는 $49.0\%,\;76.6\%,\;61.1\%$였다.
곤충병원성 선충으로부터 각각 공생박테리아를 분리하여 flask 상에서 7일간 배양하여 공생박테리아의 성장정도, 단백질 분해 효소의 생성, 배양상등액의 꿀벌부채명나방 유충에 대한 살충성 및 지방산 함량에 관한 연구를 수행한 결과 XR-PC 및 XR-MK의 성장 및 살충성이 가장 우수한 것으로 나타났으며 protease 활성은 XR-DR이 배양 4일째 최대 활성을 보였으며, 지방산 함량의 경우 XR-PC 및 XR-HY가 다른 종의 지방산 함량에 비해 12:0, 14:0, 13:0 iso, 16:1 cis 5, 17:0 cyclo에서 함량의 차이를 나타내었다.
Entomopathogenic nematodes are being used for insect control. We purified a toxin secreted by the insect-pathogenic bacterium, Xenorhadbus nematophilus, which lives in the gut of entomopathogenic nematodes. Culture broth of X. nematophilus was separated by centrifugation and concentrated by ultration. The concentrated culture broth was applied to a DEAE Sephadex A-50 column, and proteins were eluted stepwise with increasing concentrations of KCI. Fractions column. The molecty weight of purified toxin was39 kDa on SDS-PAGE, and Fourier tranformed infrared (FTIR) spectroscopy indicated that this toxin could be a new protein exhiting the charactristics of C=O stretching peak near 1650cm-1.
Mortality of some agro-forest insect pests, Agrotis segetum, Blitopertha orientalis, Agerastica coerulea, Glyphodes perspectalis and Acantholyda parki caused by entomopathogenic nematodes was investigated in laboratory and in pot. Steinernema carpocapsae All and Pocheon strain were effective against 2nd of 3rd instar larvae of A. segetum showing 100% mortalities at the concentration of 10Ijs/larva but not effective against 4th inster larvae. Mortality of B. orientalis was 100% after 26 days in H. bacteriopora NC 1, H. bacteriophora Hamyang and S. glageri NC strain treatment. S. monticulum also showed 100% mortalities against A. coerulea andd G. perspectalis at the concentration of 80 and 40 Ijs/larva. However, H. bacteriophora Cheju and S. glaseri Cheju strain were not effective against A. parki, i.e., showing 23.3 and 20.0% mortalities, respectively at the concentration of 160Ijs/larva. S. glaseri Hanrim strain was more effective than H. bacteriophora Cheju strain against Pryeria sinica.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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