• 한국양식학회지
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• 제16권1호
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• pp.51-58
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• 2003

The first Indian transgenic fish was generated in 1991 using borrowed constructs from foreign sources. To construct transformation vectors for the indigenous fishes, growth hormone genes of rohu (r-CH), Labeo rohita and catfish, Heteropneustes fossilis were isolated, cloned and sequenced; their fidelity was confirmed in prokaryotic and eukaryotic systems. A vector was constructed with grass carp b-actin promoter driving the expression of r-GH. Rohu eggs are large. fragile and swell 2~3 times. when fertilized. Hence they were amenable only for electroporated sperm-mediated gene transfer. Accordingly, the sperm electroporation technique was standardized to ensure 25% hatchling survival and 37% Presumptive transgenics without suffering any deformity. Southern analysis confirmed genomic integration in 15% of the tested individuals (Ti) belonging to family lines 2 and 3: another 25% of the Juveniles (Te) were also proved transgenic but with the transgene persisting extrachromosomally for longer than 1 to 2 years. perhaps due to the presence of replicon in the vector. Transgenics belonging to different family lines grew 6~8 times faster than the respective controls. Difference in growth trends of Ti and Te within a family line was not significant. In the Ti family 3 remarkable growth acceleration was sustained for a period longer than 36 weeks but in those of family 2, it gradually decreased. All transgenic fishes including the rohu converted the food at a significantly higher efficiency. Barring the transgenic mudloach, all the other transgenic fishes consumed food at significantly reduced rate.

• 한국수정란이식학회:학술대회논문집
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• 한국수정란이식학회 2000년도 추계학술대회 및 정기총회
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• pp.64-65
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• 2000

• 한국수정란이식학회지
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• 제17권1호
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• pp.45-53
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• 2002

본 연구는 sperm-mediated gene transfer를 이용하여 ICSI에 의한 형질전환동물 생산의 기초자료로서 활용하기 위해, ICSI에 사용될 정자의 조건과, 그에 따라 적합한 돼지 정자와 외래유전자의 전처리 및 ICSI를 통한 수정을 및 후기 배로의 발달율과 외래유전자의 발현 여부를 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다. ICSI에 이용될 정자의 조건에 따라 정소상체미부정자, 사출정자 및 동결정자를 이용하여 ICSI후 수정율은 각각 72.3%, 64.1% 및 74.1%로 나타나 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 또한 후기배로의 발달율에 있어서도 각각 17.6%, 18.7% 및 15.0%로 나타나 각 처리군간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 그리고, ICSI후 전기적 자극을 실시한 군과 실시하지 않은 군에서 난자의 활성화에 따른 수정율은 대조구로 이용한 shame injection과 전기적 활성화를 실시하지 않은 군에서 각각 47.1%와 46.3%로 나타나 전기적 활성화를 실시한 군의 79.6%에 비해 유의적인 차이를 나타내었다. 후기배로의 발달율에 있어서도 전기적 활성화를 실시한 군에서는 24.1%로 나타나 전기 적 활성화를 실시하지 않은 군에서의 14.4%와 유의적인 차이를 나타내었다. 그리고 대조구로 이용한 shame injection에 있어서 후기 배로의 발달율은 2.5%로 낮은 결과를 나타내었다. 또한, 정자와 pcDNA LacZ유전자의 처리시 electroporation 방법을 실시하여 ICSI후 난자를 각각 전기적 활성화를 실시한 군과 실시하지 않은 군에 있어서 유전자 발현율은 각각 30.2%와 24.2% 나타났으나, 두 처리군간에 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 그러나, 두 군에서 pcDNA LacZ 유전자는 모두 mosaic 발헌 양상을 보였다. 이상의 실험 결과들을 종합해 보면, ICSI에 사용될 수 있는 돼지의 정자는 정소상체미부정자, 사출정자 및 동결정자 모두가 이용 가능하며, ICSI후 추가 전기적 자극에 의한 난자의 활성화가 수정율과 후기 배로의 발달율을 향상시킬 수 있음을 시사하였다. 따라서, 돼지에 있어서 정자의 외래유전자 도입에 대한 정확하고 실용적인 방법은 보고되고 있지는 않은 상태로, 정자와 외래유전자의 처리법을 향상시키기 위하여 다양한 방법으로 많은 연구가 요구된다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.61-61
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• 2001

The main goal of this study was to produce transgenic piglets by the method of injection of sperm-mediated exogenous DNA. Spermatozoa (1$\times$106 sperm of final concentration) obtained from caudal epididymis were mixed with pBC1-hEPO (20 ng/${mu}ell$) or pcDNA3 LAC Z (20 ng/${mu}ell$), and followed by electroporation (500 V, 25 ㎌). Matured oocytes having the first polar body and dense cytoplasm were selected and centrifuged at 12,000g for 6 min. After sperm injection, the oocytes were activated electrically (1.7 ㎸/cm, 30 $\mu$ sec, single pulse) in 0.3 M mannitol solution. Eggs injected sperm were cultured in NCSU 23 medium (0.4% BSA) at 39$^{\circ}C$, 5% $CO_2$ in air for 192 h. This study were comprised 3 experiments. Experiment 1 compared the developmental efficiencies between the sperm-injected oocytes (Group 1) and further activated electrically (Group 2). Experiment 2 compared the expression of pcDNA3 LAC Z in the embryos produced by Group 1 and Group 2. Finally, experiment 3 carried out transfer of embryos (1-8 cell stage) transfected with pBC1 -hEPO into surrogate recipients synchronized by injection of combination of PG600 with hCG. The rates of cleavage and development into blastocyst stage in Group 2 were significantly higher than those of Group 1 (71.3% and 28.1% vs. 43.3% and 10.3%, respectively, p<0.05). Thirty (24.2%) out of 124 embryos analyzed in Group 2 were positive by X-gal. Similarly, in Group 1, 16.3% (8/49) were positive. After transfer of 789 embryos to 7 recipient gilts, three out of them examined by ultrasound became pregnant. One recipient is in day 50 pregnancy. On day 54 of gestation, two were carried out uterotomy in order to confirm the pregnancy One had 7 and another had 2 fetuses. We conclude that injection of sperm-mediated gene transfer will be used as a valuable tool for the production of transgenic piglets.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권4호
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• pp.339-347
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• 2001

정자를 매개체로 한 유전자 전이는 형질 전환 동물의 생산을 위한 가능성 있는 간단한 방법이다. 또한 세포질내 정자 주입법에 의한 외래 유전자의 전이에 의한 형질 전환 동물의 생산이 최근에 보고되었다. 본 연구에서는 정자를 EGFP유전자와 공배양한 후 이를 난모세포내에 미세 주입한 다음, 수정란의 발달과 EGFP유전자의 발현을 조사하였다. 돼지 난자에 정자, 세포질막이 파괴된 정자 또는 정자를 주입하였다. 주입 후 수정된 난자는 NCSU23 배양액에서 배반포까지 배양하였으며, 배발생율과 EGFP 유전자의 발현을 연구하였다. 정자를 미세 주입한 결과 난할율은 67.0%로 정자두부를 미세주입한 난할율인 59.7%보다 높았고, 수정란의 EGFP 유전자 발현율은 각각 42.1와 20.0%로서 전자가 유의하게 높았다. 세포질막을 파괴하기 위해 다른 방법들로 정자를 처리하여 주입하였을 시 구정란의 배발생율에 영향을 주지 않았다 정자, 세포막이 파괴된 정자를 주입하여 배반포 발생율을 조사한 결과, 15.0과 14.2%로서 유의차가 없었다. 동결융해하거나 Triton X-100으로 처리한 정자를 주입하여, EGFP 발현율을 조사한 결과, 동결융해 정자를 사용했을 때의 성적이 38.4%로 타군의 성적인 22.4%에 비해 유의하게 높았다. 미세 주입에 앞서 정자는 EGFP 유전자의 0.01 ng/${\mu}\ell$ 부터 1 ng/${\mu}\ell$까지의 여러 농도로 배양되었다. 그러나 난할율을 조사한 결과 EGFP 유전자의 농도 차이에 따른 유의차가 없었다. 정자 배양액에 첨가된 EGFP 유전자의 농도가 0.1 ng/$m\ell$일 때 EGFP 발현율은 37.4%로서 가장 높은 결과를 보였다. 따라서 본 연구의 결과에 의하면 세포질막을 제거한 정자에 외래 유전자가 묻게 되며, 이 정자는 외래유전자를 수정란내로 옮겨 매개체로서의 역할이 가능할 것으로 생각된다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제30권3호
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• pp.189-194
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• 2006

Sperm-mediated gene transfer(SMGT) can be used to transfer exogenous DNA into the oocyte at fertilization. The main objective of this study was to assess efficiency of transferring mitochondrial DNA(mtDNA) fragment into boar spermatozoa in either presence or absence of liposome and quality of transfected spermatozoa. The mtDNA of chicken liver was isolated and purified by phenol and alkaline lysis extraction, and it was inserted to plasmid. The genome of transfected spermatozoa treated with DNase I was purified by alkaline lysis, and then amplified by the PCR analysis. After electrophoresis, DNA quantitation of each well was calculated by comparison of the band intensity with standard. As a result, exogenous DNA was composed of mtDNA fragment(1.2 kb) and plasmid(2.7 kb). On the other hand, efficiency of transfection by liposome($9.0{\pm}0.34ng/{\mu}l$) in SMGT was higher than that by DNA solution($6.9{\pm}0.53ng/{\mu}l$). However, there was no significant difference. Transfering exogenous DNA into spermatozoa was completed within 90 min of incubation. In another experiment, there were significant (p<0.05) differences between transfected spermatozoa using both DNA solution and DNA/liposome completes with unheated spermatozoa for viability ($70.8{\pm}1.80$ and $68.0{\pm}2.16%$ vs. $83.3{\pm}1.69%$, respectively) and motility($78.7{\pm}1.59$ and $79.3{\pm}2.14%$ vs. $86.7{\pm}1.59%$, respectively). This study indicates that exogenous mtDNA can be efficiently transferred into boar spermatozoa regardless of the presence of liposome, and transfected spermatozoa can also use insemination and in vitro fertilization to generate transgenic pig.

• 한국가축번식학회지
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• 제22권2호
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• pp.145-152
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• 1998

Many trials have been made to produce transgenic animals using sperm cells as a vector transferring foreign DNA into eggs, but reliable results are yet to be obtained (Brinster et al., 1989; Lavitrano et al., 1989; Bachiller et al., 1991; Sato et al., 1994). Recently, one of author(SO) demonstrated that mouse blastocysts derived from eggs fertilized by spermatozoa of male mice single injected with liposome-DNA complexes within the testis expressed thegene (Ogawa et al., 1995.) Here we report that a single injection of liposome-encapsulated DNAs into the testis of either male rats or mice resulted in successfully gene transfer to the postpartum progeny. The expression of mRNA derived from transgenes was also demonstrated in transgenic animals thus obtained. Further, the transmission of the exogenous gene to the descedants was confirmed in one line of transgenic rat up to F4 generation, indicating that the gene was stably incorporated into the germ line. Thus, direct single injection of foreign DNA into the testis provides a novel and convenient means to generate transgenic animals.

• 한국가축번식학회지
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• 제23권1호
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• pp.13-18
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• 1999

정소내 성숙한 정자를 생산하는 전능성을 가진 정조세포는 체세포와 동일수준으로 외래 유전자를 삽입 가능한 것으로 알려져 있다. 그러나, 이들 세포가 반수체 이후의 단계로 분화한 경우에는 왜래 유전자를 삽입하기보다는 단순히 결합하는 능력이 있는 것으로 알려져 있다 . 따라서, 본 연구는 외래 유전자를 정소실질내 주입함으로써 형질전환 동물생산이 가능한지에 대하여 검토하기 위하여, 한쪽 정소를 거세한 한국 재래산 양을 사용하였다. Liposome /DNA 복합체를 1 : 2의 비율로 희석한 후 정소실실내에 주입하여 정자를 경유한 유전자 전이의 가능성을 확인하였다. 또한 동결보존한 정액을 인공수정하기 위하여 PGF$_2$$\alpha$(0.15mg/kg/BW)를 근육 주사함으로써 인위적으로 발정을 유도한 후, 인공수정을 이용하여 임신과 분만을 유도하였다. 이들 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. PCR에 의하여, 유전자 도입 후 채취한 정액에서 외래유전자는 80일 이상 존재하였으며, 가장 높은 전이율은 40 일째 얻어졌다. 이들 결과는 정조세포에 외래 유전자가 성공적으로 삽입되었음을 제안하였다. 2. 23 두 (평균 96 % 의 발정 유기율)의 재래산양에게 인공수정을 실시한 결과 이들 중 4두가 임신되어 7두의 자양이 생산되었다. 3. 생산된 7두의 산자중 genome DNA를 추출하여 PCR 및 Southern blotting을 실시 한 결과 2두가 형질전환으로 확인되었다. 이상의 결과로서 정자를 매개로 한 정소실질내 외래 유전자의 주입법은 형질전환의 생산을 위한 매우 유용한 수단으로 사용 가능함을 제안하였다.

• 한국가금학회지
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• 제27권2호
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• pp.155-161
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• 2000

Unfortunately, there is no technique which is stable and repetitive to produce transgenic chicken, although various ways of gene transfer including PGC-and embryonic cell-mediated gene transfer, DNA microinjection, virus inoculation and sperm cells have been employed. The aims of this study were 세 develop and establish such a stable, repetitive and efficient way of gene transfer giving a faithful gene expression during development after the reconstruction of embryo in an UV-irradiated egg. A dual reporter plasmid (pJJ9), a fusion gene containing lacZ and GFP driven by a CMV promoter was used to exploit either merits of both reporting markers. lacZ with strong signal or GFP with vital marking. Electroporated embryonic blastodermal cells (EBCs) in the presence of the pJJ9 DNA faithfully showed 377 bp PCR product and lacZ or GFP expressions in the identical cells in vitro of in vivo. Furthermore, analyses of expression pattern of the foreign DNA demonstrated that microinjected EBCs cells into the UV-irradiated recipient egg should participate in normal developmental process, for example, proliferation and differentiation into various tissues. Thirty percentages of the manipulated eggs showed lacZ expression in their tissues. These results together with the specific procedures used in this study should facilitate avian transgenesis.

• 미생물학회지
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• 제43권3호
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• pp.151-158
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• 2007

유전자치료W터의 주입시 생식세포를 통한 다음 세대로의 전달 가능성은 안전성 측면에서 관심을 중대시키고 있다. 특히 전립선암이나 난소암의 치료시 바이러스를 생식기관에 인접한 부위에 주입하여야 하므로 그 가능성이 높다. 따라서 본 연구에서는 유전자치료에 많이 이용되는 아데노바이러스를 매개로하여 tumor suppressor 유전자인 p53을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 제조하여 이를 투여시 생식장기를 포함한 주요장기조직에의 분포와 germ cell을 통한 차세대로의 전달 가능성 등의 생식독성을 조사하였다. In vivo biodistribution study를 위하여 $Ad-CMV-{\beta}-gal$흑은 Ad-CMV-p53를 마우스 암 수의 복강에 주사한 후 생식장기를 포함한 주요 장기에서 아데노바이러스 유래 DNA검출 및 RNA발현 여부를PCR과 RT-PCR로 각각 확인하였다. 그 결과 간 및 비장과 같은 일반 장기에서도 주입한 외부유전자의 DNA가 검출되거나RNA가 발현되었을 뿐만 아니라, 정낭, 전립선, 부고환, 난소 및 자궁 등의 생식장기에서도 주입한 외부유전자가 검출되거나 발현되는 것으로 나타났다. Real-time PCR을 이용하여 각 장기에서의 투여된 아데노바이러스 벡터는 시간 의존적으로 감소되는 것을 정량하였다. Ad-CMV-p53를 암 수 마우스의 난소와 고환에 각각 직접 주사하여 교배시킨 후 그 후세대의 DNA를 분리하여 주입한 아데노바이러스 유래의 DNA를 검색한 결과, 어떠한 차세대에서도 주입한 아데노바이러스 유래의 DNA가 검출되지 않았다. 한편 생식장기에서의 PCR및 RT-PCR signal유래 vector의 위치를 확인하기 위해 매우 감도가 높은 in-situ PCR로 조사한 결과 고환의 경우 간질조직으로의 전달은 일어나나 정세관 내에는 아데노바이러스 벡터가 전달되지 않으며, 난소에서도 아데노바이러스벡터는 난포내의 난자에 전달되지 않고 기질조직에 존재하는 것으로 확인되었다. 결론적으로 복제 능력 이 결여된 아데노바이러스를 매개로 한 유전자치료제는 생식 장기에서 검출되더라도 다음 세대로 전달될 가능성은 대단히 낮음을 제시한다.