• Reproductive and Developmental Biology
• /
• 제32권3호
• /
• pp.199-203
• /
• 2008

본 연구는 한우 체세포를 이용하여 생산된 복제란을 한우 대리모에 이식하여 임신이 확인된 개체에서 임신 기간 중 주요 호르몬의 발현 특성을 인공수정으로 임신된 대리모와 비교 분석하고자 실시하였다. 한우 섬유아세포를 이용하여 생산된 체세포 복제란을 자연발정으로 동기화된 한우 대리모에 이식하여 임신이 확인된 개체를 공시하였으며(n=8), 대조군으로는 인공수정으로 임신된 대리모을 사용하였다(n=5). 발정 관찰 후 60일경에 직장검사로 임신을 확인하였다. 주요 스테로이드 호르몬인 progesterone(P4)와 estradiol-l7$\beta$ (E2) 농도는 방사선동위원소 면역분석시험(RIA) 방법을 이용하였으며, 혈중 cortisol 농도는 ELISA 방법으로 측정하였다. 인공수정한 대리모의 경우 E2 농도가 분만 시기에 급격하게 증가하였으나, P4 농도는 분만 시기에 급격하게 감소하는 경향을 나타내었다. 이에 반해 복제란 이식우의 혈장 P4 농도는 분만 50일 전부터 분만 10일전까지는 대조군과 유사하게 유지되었으나, 분만예정일에는 전혀 떨어지지 않고 높은 수준으로 유지되었다. 한편, 복제란 이식우에서 분만 때까지 정상적으로 임신이 유지된 대리모들의 경우는 임신 기간 동안 cortisol 농도는 임신 후반기까지 낮게 유지되며 별다른 변화를 나타내지 않았다. 반면에 유산이 일어난 개체의 경우에는 임신 100일경에 cortisol의 농도가 급격하게 증가하는 것을 확인하였다. 이상의 결과를 종합하여 보면, 복제란 이식우의 경우 분만예정일 전 후에 일어나는 급격한 호르몬의 변화가 일어나지 않음을 확인할 수 있었으며, 이러한 현상은 복제란 이식우의 분만 지연과 밀접한 관계가 있는 것으로 사료된다.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제25권4호
• /
• pp.221-227
• /
• 2010

Early cleavage is a reliable prognostic tool for successful embryo transfer in assisted reproduction because early cleaved embryo show better pregnancy rate after transfer. There for, preparation of good embryo recipient is important factor to optimize efficiency of pig cloning. The present study was performed to evaluate the effect of early cleavage on the in vivo development of cloned embryos and to analyze breed, parity and estrous synchrony to optimize recipient for pig cloning. In vitro matured porcine oocytes derived from local slaughterhouse and fibroblasts derived from miniature pig fetuses were used for somatic cell nuclear transfer (SCNT). Reconstructed embryos were transferred to recipient pigs on the same day of SCNT or after 1~2 days of in vitro culture for selecting early cleaved embryos. Breed, parity and date of standing estrous of recipients were recorded for analysis. After 25~35 days after embryo transfer pregnancy was diagnosed using ultrasonography, and pregnant recipients were monitored till delivery. Between purebred and crossbred, no significant difference was founded in both pregnancy and delivery rates. However, early cleaved embryos showed significantly higher pregnancy (46.2%) and delivery (12.8%) rates compared to non-selectively transferred group (24.8% and 4.5%, respectively). The results also showed that the recipients showing standing estrous on the same day of SCNT and less than 4 parities were most suitable for pig cloning.

• Reproductive and Developmental Biology
• /
• 제35권1호
• /
• pp.67-75
• /
• 2011

The faulty regulation of imprinting gene lead to the abnormal development of reconstructed embryo after nuclear transfer. However, the correlation between the imprinting status of donor cell and preimplantation stage of embryo development is not yet clear. In this study, to determine this correlation, we used the porcine spermatogonial stem cell (pSSC) and fetal fibroblast (pFF) as donor cells. As the results, the isolated cells with laminin matrix selection strongly expressed the GFR ${\alpha}$-1 and PLZF genes of SSCs specific markers. The pSSCs were maintained to 12 passages and positive for the pluripotent marker including OCT4, SSEA1 and NANOG. The methylation analysis of H19 DMR of pSSCs revealed that the zinc finger protein binding sites CTCF3 of H19 DMRs displayed an androgenic imprinting pattern (92.7%). Also, to investigate the reprogramming potential of pSSCs as donor cell, we compared the development rate and methylation status of H19 gene between the reconstructed embryos from pFF and pSSC. This result showed no significant differences of the development rate between the pFFs ($11.2{\pm}0.8%$) and SSCs ($13.3{\pm}1.1%$). However, interestingly, while the CTCF3 methylation status of pFF-NT blastocyst was decreased (36.3%), and the CTCF3 methylation status of pSSC-NT blastocyst was maintained. Therefore, this result suggested that the genomic imprinting status of pSSCs is more effective than that of normal somatic cells for the normal development because the maintenance of imprinting pattern is very important in early embryo stage.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제22권2호
• /
• pp.89-95
• /
• 2007

본 연구는 재래 산양의 체세포 핵이식에 의하여 생산한 복제 산양(진순이)의 조직으로부터 공여 핵을 배양하여 다시 핵이식을 실시하여 재복제에 따른 융합율과 분할율, 이식 후의 수태율 등을 조사하여 재복제 가능성 여부를 검토하기 위하여 실시하였다. 공여 세포는 귀 유래 섬유아세포를 분리 배양하여 사용하였으며, 체내 성숙 난자는 성숙한 미경산 재래 산양에 과배란을 유기하여 외과적인 방법으로 난관 관류를 통해 회수하여 핵이식을 실시하였다. 핵이식란의 융합은 전기 자극 방법으로 실시되었으며, 융합이 완료된 핵이식란의 활성화 처리는 핵이식 3시간 후에 Ionomycin과 6-DMAP를 병용 처리하여 실시하였다. 복제 수정란의 체외 배양은 0.8% BSA가 첨가된 mSOF 배양액으로 $2{\sim}4$ 세포기까지 체외 배양을 실시한 다음 수란 산양의 난관에 외과적으로 이식하였다. 임신 진단은 발정일로 부터 제 30일과 60일째에 초음파 임신 진단기로 임신 진단을 실시하고, Progesterone농도는 이식 후 21일째와 63일째의 혈액을 채취하여 RIA 방법으로 검사하였다. 체세포 핵이식에 의한 재복제란(2nd)을 전기 자극에 의한 융합을 1회 실시하였을 때 융합율은 65.9%로서 복재란(1st)의융합을 51.0%보다 유의적(p<0.05)으로 높았으며, 2회 전기자극을 실시하였을 때는 각각 77.4 및 63.9%로서 차이가 없었으나, 3회 재복제란 융합율도 87.5%로서 복제란의 70.1%와 유의적인 차이는 없었다. 재복제 융합란의 분할율은 56.0%로j 복제 융합란의 77.7%보다 낮았다. 재복제란을 수란 산양에 이식을 실시하여 임신 제21일과 63일째 임신 진단을 실시하였을 때 수태율을 수란 산양의 발정유기 방법에 따른 수태율에 있어서 재복제란의 21일째 수태율은 39.3%로서 복제란의 17.4%보다 높았으며, 63일째는 각각 14.3 및 13.0%로서 복제 회수에 따른 수태율의 차이는 없었다. 수란 산양의 발정 유기 방법에 있어서 제 21일째에 자연발정이 발현된 수란 산양의 수태율은 45.4%로서 인위적으로 발정 동기화를 유도한 수란 산양의 35.3%보다 높았다. 제 63일째는 각각 18.2 및 11.8%로서 차이가 없었다. 이상의 결과로 볼 때 재래 산양의 체세포 핵이식에 의한 복제효율에 있어서는 복재와 재복제간에 차이가 없었으며, 수란산양의 발정 동기화 방법에 따른 수태율에 있어서도 차이가 없었다. 그러나 앞으로 재래 산양의 복제 효율 개선을 위해서는 양질 난자의 다량 확보, 산양 수정란의 체외 배양 체계 확립, 이식 기법의 개발 등에 관한 후속 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다.

• Reproductive and Developmental Biology
• /
• 제30권1호
• /
• pp.53-58
• /
• 2006

본 연구는 한우 성체 유래 귀세포(Korean bovine ear skin fibroblasts, KbESF)와 태아 섬유아세포(Korean bovine fetal fibroblasts, KbFF)를 이용한 체세포 복제(SCNT) 시 세포종류, 배양기간 그리고 융합방법이 핵이식 수정란의 발달에 미치는 영향을 알아보기 위하여 실시하였다. 태아 섬유아세포는 임신 51일령의 한우태아에서 분리하였고, 귀세포는 28개월령의 성우의 귀에서 채취하였다. 세포는 15주 동안 체외에서 배양하며 체세포 핵이식(SCNT)에 공시하였다. 융합방법을 비교하기 위해 챔버방법과 전극 바늘을 이용한 방법으로 핵과 세포질을 융합하였다. 세포의 doubling time은 KbFF에서 17.3시간, KbESF에서 24.3시간으로 나타났다. 핵이식 후 융합과 분할율은 needle 방법에서 보다 유의적으로 높았으나(각 각 76.1과 81.2%, P<0.05), 배반포 발달율은 차이가 없었다. KbESF의 경우, 배반포 발달율은 passage $5{\sim}9$(39.4%)와 $13{\sim}15$(40.4%)에서 passage $1{\sim}4$에 비하여 유의적으로 높았다(P<0.05). KbFF의 경우, 융합율은 passage $5{\sim}8$과 $13{\sim}15$에서 각각 75.0 및 76.8%로 passage $1{\sim}4$(61.5%)보다 높았으나, 난분할율과 배반포 발달율은 차이가 없었다. 결론적으로, SCNT 수정란의 발달은 융합 방법에 의해 영향을 받을 수 있으나, 계대배양 15회까지 장기배양을 한 경우는 복제수정란의 발육에 영향을 주지 않는 것으로 판단된다.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제30권3호
• /
• pp.175-181
• /
• 2015

본 연구에 사용된 공시축은 2013년 1월부터 2014년 12월까지 국립축산과학원 가축유전자원센터에서 사육 중인 모색을 기준으로 동일연령인 일반한우(황우), 백한우 및 복제소 18두(황우 10두, 백우 7두 그리고 복제소 1두)를 대상으로 혈액학적 수치를 확인하였다. 동일연령의 복제소와 백한우의 성장 단계별 혈액학적 검사 결과에서 1년 이하에서 1~2년으로 연령이 증가됨에 따라 RBC 관련 6개의 인자의 측정수치가 정상치 범위내 임을 확인했다. 또한 일반한우와의 비교에서도 차이점이 인정되지 않았다. 하지만, 복제소를 포함하는 백한우군와 일반 한우군 간의 RBC($11.2{\sim}10.1{\times}10^6/{\mu}l$, $12.0{\sim}10.3{\times}10^6/{\mu}l$로)와 PL치($592{\sim}448{\times}10^3/{\mu}l$, $589{\sim}450{\times}10^3/{\mu}l$로)에서 각각 유의성 있는 감소(P<0.05)가 인정되었다. 또한, 복제소와 백한우의 백혈구계 검사 결과에서도 1년 이하에서1~2 년으로 연령이 증가함에 따라 WBC 수치($12.0{\sim}11.1{\times}10^3/{\mu}l$, $12.5{\sim}10.0{\times}10^3/{\mu}l$)가 감소했지만, 정상치 범위 내의 결과를 확인했다. 백혈구 분포의 백분율에서는 전반적으로 복제소 및 백한우의 림프구가 41.0~39.0%, 43.1~41.6%이며, 분엽형 호중구 수치는 32.0~29.0%, 33.9~30.9%로 나타났다. 일반 한우군과 복제소를 포함하는 백한우군 간의 백혈구계의 림프구 수치의 비교에서는 백한우군(41.6%)로, 일반한우(45.1%)에 비하여 유의적으로 낮음(P<0.05)을 확인하였다. 본 연구결과를 통하여 백한우의 귀체세포 유래의 복제소의 혈액학적 분석 결과로 건강상에 문제점이 없음을 확인하였다.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
• /
• 제25권1호
• /
• pp.44-51
• /
• 2012

Calcium ions play an important role in the establishment and maintenance of pregnancy, but molecular and cellular regulatory mechanisms of calcium ion action in the uterine endometrium are not fully understood in pigs. Previously, we have shown that calcium regulatory molecules, transient receptor potential vanilloid type 5 (TRPV6) and calbindin-D9k (S100G), are expressed in the uterine endometrium during the estrous cycle and pregnancy in a pregnancy status- and stage-specific manner, and that estrogen of conceptus origin increases endometrial TRPV6 expression. However, regulation of S100G expression in the uterine endometrium and conceptus expression of S100G has been not determined during early pregnancy. Thus, we investigated regulation of S100G expression by estrogen and interleukin-$1{\beta}$ (IL1B) in the uterine endometrium and conceptus expression of S100G during early pregnancy in pigs. We obtained uterine endometrial tissues from day (D) 12 of the estrous cycle and treated with combinations of steroid hormones, estradiol-$17{\beta}$ ($E_2$) and progesterone ($P_4$), and increasing doses of IL1B. Real-time RT-PCR analysis showed that $E_2$ and IL1B increased S100G mRNA levels in the uterine endometrium, and conceptuses expressed S100G mRNA during early pregnancy, as determined by RT-PCR analysis. To determine if endometrial expression of S100G mRNA during the implantation period was affected by the somatic cell nuclear transfer (SCNT) procedure, we compared S100G mRNA levels in the uterine endometrium from gilts with SCNT-derived conceptuses with those from gilts with conceptuses derived from natural mating on D12 of pregnancy. Real-time RT-PCR analysis showed that levels of S100G mRNA in the uterine endometrium from gilts carrying SCNT-derived conceptuses was significantly lower than those from gilts carrying conceptuses derived from natural mating. These results showed that S100G expression in the uterine endometrium was regulated by estrogen and IL1B of conceptus origin, and affected by the SCNT procedure during early pregnancy. These suggest that conceptus signals regulate S100G, an intracellular calcium transport protein, for the establishment of pregnancy in pigs.

• 한국수정란이식학회지
• /
• 제33권3호
• /
• pp.139-147
• /
• 2018

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a useful biotechnological tool for animal cloning. Until now, SCNT has been inefficient, especially in dog. It is believed that an embryo developmental block in SCNT embryos is cause of low production efficiency. However, no studies have been performed on canines for embryo developmental block. In this study, we attempted to evaluate the beneficial role of EDTA in canine parthenogenic (PA) embryos development to overcome embryo developmental block. The PA embryos were divided into 0.01 mM EDTA treated and non-treated groups. Embryo developmental efficiency was measured by activating chemically parthenote. After EDTA induction, PA embryos were evaluated for embryonic development, Reactive Oxygen Species (ROS) activity, mitochondrial integrity, ATP production and genomic activation. The EDTA treated PA embryos showed significantly higher survival rate and improved cavity formation compared to non-treated. Furthermore, cytoplasmic ROS level was mitigated and mitochondrial membrane potential was found significantly higher in EDTA treated group followed by higher ATP production. Moreover, major embryonic genomic activation specific markers/factors were also elevated in EDTA treated group. Conclusively, we elucidated that EDTA showed substantially positive effect to overcome embryo developmental block in canine.

• 한국축산식품학회지
• /
• 제32권4호
• /
• pp.389-395
• /
• 2012

Cloned animals are a result of asexual reproduction of animals using somatic cell nuclear transfer. Ever since the first report of a cloned sheep 'Dolly' produced by SCNT, increasing numbers of livestock, such as bovine and swine clones, have been generated worldwide. Foods derived from cloned animals have not been produced yet. However, the food safety of cloned animals has provoked controversy. The EU Food Safety Authority and U.S. Food and Drug Administration announced that milk and meat from cloned and non-cloned animals have no difference regarding food safety. However, food derived from cloned animals is considered unsuitable for eating vaguely. Moreover, there were scant information about cloned animals in Korea. Therefore, we surveyed the number of cloned animals worldwide including Korea and summarized the reports for cloned animals and discussed predictable problems.

• Reproductive and Developmental Biology
• /
• 제30권3호
• /
• pp.175-180
• /
• 2006

본 연구는 융합 전 수핵란의 활성화 처리 유무와 활성화 처리 시간이 소 체세포유래 핵이식란의 체외 발육능에 미치는 영향을 검토하기 위해 수행하였다. 소 체외성숙란의 탈핵 후 체세포 핵을 이식하고 일부는 전기 융합 후 활성화를 유기하였고(pre-AC), 일부는 먼저 활성화 처리 후 융합을 실시(post-AC)하였다. 난자의 활성화는 $Ca^{2+}$-ionophore(A23187)로 처리 후 DMAP로 4시간 배양하는 방법으로 유기하였다. 핵이식란은 CR1aa액에서 9일간 배양하여 발육율을 검토하였으며, 활성화 후 30분${\sim}$2.5시간에 고정하여 confocal microscope하에서 핵형 변화를 검사하였다. 배반포기까지 발육율은 post-AC구(20.6%)가 pre-AC(15.3%)보다 다소 높게 나타났다. 또한 활성화 처리를 하여 핵이식란의 배 발달을 비교한 결과 post-AC구가 더 늦은 배 발달 속도를 나타내었다. Post-AC구를 활성화 후 30분, 2시간, 4시간으로 나누어 융합하여 발육율을 검토한 결과 발육율에 차이가 없었다. 본 연구의 결과는 수핵란의 활성화 시간에 따라 핵이식란의 발육 및 핵형이 영향을 받을 수 있음을 시사한다.