• 제목/요약/키워드: Solid culture

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반응표면방법에 의한 Phellinus sp. 고체배양의 최적화 (Optimization for Solid Culture of Phellinus sp. by Response Surface Methodology)

  • 강태수;강안석;손형락;강미선;임양이;이신영;정성모
    • 한국균학회지
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    • 제26권2호통권85호
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    • pp.265-274
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    • 1998
  • 목질진흙버섯(Phellinus sp.) 자실체의 인공재배를 위한 기초자료마련의 일환으로 자실체로부터 순수분리한 상황속의 한 균주를 이용하여 참나무 (Quercus aliena), 뽕나무(Morus alba) 및 오리나무(Alnus japonica)의 3종 톱밥기질에 따른 균사생육의 최적조건을 반응표면분석방법으로 조사하였다. 균사생육에 영향을 미치는 3종의 독립변수(쌀겨첨가량, 배지의 초기 pH 및 수분함량)와 그 최적값을 검토한 결과, 쌀겨첨가량은 3종의 톱밥배지 모두에서 약 30%(w/w) 첨가시에 가장 좋았으며, 수분함량은 $65{\sim}70%(w/v)$ 범위 에서 좋았다. 배지의 초기 pH는 참나무와 뽕나무에서는 $pH\;5{\sim}6$, 오리나무 톱밥배지의 경우는 pH 6에서 가장 좋았다. 균사의 생육온도는 모든 톱밥배지에서 $25{\sim}30^{\circ}C$의 온도범위에서 좋았으나, 톱밥수종에 따른 차이를 보였다. 균사생육에 영향을 미치는 쌀겨첨가량$(X_1)$, 배지의 초기 $pH(X_2)$ 및 수분함량 $(X_3)$을 각각 종속변수로 하고, 균사의 생육길이를 독립변수(Y)로 하여 반응 표면분석한 결과, 참나무 톱밥의 경우, 쌀겨첨가량 31.01%(w/w), 배지의 PH 5.31, 그리고 수분함량 69.03%(w/v)에서 얻어졌으며, 이때 기대되는 균사의 생육길이는 8.32cm이었다. 특히, 쌀겨 첨가량$(X_1)$과 수분함량$(X_3)$)의 회귀계수가 높아, 이 변수들이 균사생육에 큰 영향을 미침을 알 수 있었다. 뽕나무 톱밥배지의 경우, 쌀겨첨가량, 배지의 초기 pH 및 수분함량의 정상점은 각각 28.77%(w/w), 5.28및 69.8%(w/v)로, 예측되는 균사의 생육길이는 7.60 cm이었다. 오리나무 톱밥 배지의 정상점은 쌀겨첨가량 28.74%(w/w), 배지의 pH 6.04및 수분함량 66.96%(w/v)으로, 이때, 예상되는 균사의 생육길이는 5.38cm이었다. 이상의 결과로부터 목질진흙버섯의 균사 생육과 독립변수들 사이에는 상관관계가 높았고, 쌀겨첨가량과 배지의 초기 pH가 수분함량보다 균사생육에 더 큰 영향을 미쳤으며, 목질진흙버섯의 균사 생육을 위한 최적의 톱밥 수종은 참나무(Quercus aliena)>뽕나무(Morus alba)>오리나무(Alnus japonica)의 순이었다.

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Well-Plate를 사용한 치과용 유니트 수관 바이오필름 모델 확립 (Establishment of a Dental Unit Biofilm Model Using Well-Plate)

  • 윤혜영;이시영
    • 치위생과학회지
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    • 제17권4호
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    • pp.283-289
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    • 2017
  • DUWL에 형성한 바이오필름을 효율적으로 제거할 수 있는 새로운 소독제는 개발되어야 하며, 실험실에서 소독제의 효과를 확인하기 위해 DUWL 바이오필름 시료는 필요하다. 이 연구의 목적은 well plate를 사용하여 간단하고 재현 가능한 DUWL 바이오필름 모델을 개발하는 것이다. 사용중인 4대의 DUWL에서 배출된 1 L의 물을 여과지에 여과시켜 세균을 얻었다. 여과지를 PBS (pH 7.4) 용액 20 ml에 현탁시킨 후, 현탁액을 R2A 액체배지에 접종하고 $25^{\circ}C$에서 10일 동안 배양하였다. 10일 배양한 세균 배양액을 $-70^{\circ}C$에 보관하였고 매 실험에 사용하였다. 세균배양액을 R2A 배지에서 5일 동안 회분 배양하였다. 12-well plate에 회분 배양한 세균 배양액과 멸균한 폴리우레탄 튜빙 조각을 넣고 정체된 상태로 $25^{\circ}C$에서 바이오필름을 형성시켰다. R2A 액체배지는 2일마다 2 ml씩 교체해주었다. 폴리우레탄 내형성된 바이오필름의 축적량을 확인하기 위해 폴리우레탄 튜빙 조각을 내면에서 수집한 바이오필름을 R2A 고체배지에 도말하였다. 도말한 R2A 고체배지는 $25^{\circ}C$에서 7일 배양하고 $CFU/cm^2$를 계산하였다. 그리고 바이오필름의 두께와 구성 세균의 형태 및 분포를 확인하기 위해 CLSM과 SEM을 사용하였다. 4일 동안 배양시킨 바이오필름의 평균 축적량은 $1.15{\times}10^7CFU/cm^2$였다. 바이오필름은 구균, 짧은 길이의 간균, 그리고 중간길이의 간균을 포함하고 있었고 폴리우레탄 튜빙 내면에 넓게 분포하고 있었다. 바이오필름두께는 위치에 따라 차이가 있지만 $2{\mu}m{\sim}7{\mu}m$였다. 이 연구에서 제작된 DUWL 바이오필름 model은 DUWL에서 수집된 모든 세균을 사용하여 세균의 다양성을 확보했고 또한 실험실에서 쉽게 구할 수 있는 well-plate를 사용했기 때문에 비용 효율적이고 재현이 간단하다. 본 연구의 DUWL 바이오필름 모델은 새로운 소독방법의 개발하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

가시오가피 버섯균사체 발효물의 기능성 식품 소재 개발 (Development of Functional Food Materials from Acanthopanax senticosus-Fermented Mushroom Mycelia)

  • 조주현;최구희;박인재;백순옥;김형하;김충식
    • 한국식품영양과학회지
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    • 제43권3호
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    • pp.411-418
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    • 2014
  • 가시오가피(Acanthopanax senticosus)의 잎과 줄기를 천연물배지로 발효미생물인 영지버섯, 노루궁뎅이버섯 및 상황버섯균사체를 각각 최적조건으로 발효하여 3종의 가시오가피-버섯발효물인 가시오가피 영지버섯균사체 발효물, 가시오가피 노루궁뎅이버섯균사체 발효물, 가시오가피 상황버섯균사체 발효물을 얻었으며 이를 건강기능식품 소재로서 이용하고자 하였다. 우선적으로 배양용 시험관과 실험실용 배양병을 사용하여 버섯균사체별 가시오가피의 천연배지로서 최적혼합비율을 검토한 결과 영지버섯균사체, 노루궁뎅이버섯균사체 및 상황버섯균사체의 가시오가피 줄기와 잎의 혼합비율을 각각 80:20, 50:50, 50:50으로 확립하였으며, 이 조건을 가지고 산업용 배양포트(2,000 mL)에서의 최적배양시간을 검토한 결과 영지버섯균사체 14일, 노루궁뎅이버섯균사체 40일, 상황버섯균사체 30일로 확립하였다. 상기와 같이 최적화된 조건으로 배양된 3종의 가시오가피 버섯균사체 발효물들을 물과 70% 에탄올로 추출, 여과, 농축, 동결건조를 수행하여 가시오가피 버섯균사체 발효물 추출분말인 열수추출물(FM-5111, FM-5121, FM-5131)과 70% 에탄올추출물(FM-5112, FM-5122, FM-5132)을 얻었다. 이 가시오가피 버섯균사체 발효물 추출분말의 eleutheroside B와 eleutheroside E를 분석한 결과, eleutheroside B는 FM-5111 $0.050{\pm}0.003mg/g$, FM-5121 $0.067{\pm}0.001mg/g$, FM-5131 $0.026{\pm}0.001mg/g$, FM-5112 $0.038{\pm}0.002mg/g$, FM-5122 $0.053{\pm}0.005mg/g$, FM-5132 $0.025{\pm}0.001mg/g$의 함량을 나타내었고, eleutheroside E는 FM-5111 $0.052{\pm}0.014mg/g$, FM-5121 $0.047{\pm}0.003mg/g$, FM-5131 $0.078{\pm}0.003mg/g$, FM-5112 $0.045{\pm}0.002mg/g$, FM-5122 $0.040{\pm}0.002mg/g$, FM-5132 $0.080{\pm}0.011mg/g$의 함량을 보였으며, ${\beta}$-glucan의 경우 FM-5111 $4.47{\pm}0.14%$, FM-5121 $3.41{\pm}0.15%$, FM-5131 $4.15{\pm}0.06%$, FM-5112 $5.18{\pm}0.36%$, FM-5122 $3.74{\pm}0.40%$, FM-5132 $4.37{\pm}0.32%$의 함량이 측정되었다.

Chlorella vulgaris CHK0008 시비가 유기농 딸기와 엽채소의 저장성과 신선도 향상에 미치는 영향 (Effect of Chlorella vulgaris CHK0008 Fertilization on Enhancement of Storage and Freshness in Organic Strawberry and Leaf Vegetables)

  • 김민정;심창기;김용기;박종호;홍성준;지형진;한은정;윤종철
    • 원예과학기술지
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    • 제32권6호
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    • pp.872-878
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    • 2014
  • 이 연구는 생물비료로서 클로렐라(Chlorella vulgaris) 분무처리에 의한 유기농 딸기와 엽채류의 신선도와 저장성 향상을 목표로 하였다. 클로렐라 균주 CHK0008은 유기농 벼재배 논의 담수에서 분리하였으며 형태적 특징과 18S rDNA와 23S rDNA 염기서열 비교에 의해 C. vulgaris로 동정하였다. 실험에 사용한 C. vulgaris CHK0008 균주는 BG11 변형배지(BGMM)에서 잘 배양되었으며 UV/VIS 분광광도계로 680nm에서 흡광도를 측정하였을 때 1 OD의 C. vulgaris CHK0008는 $2.15{\times}10^6cell/mL$ 농도로 개산하였다. 클로렐라(C. vulgaris)의 엽면처리구와 무처리구를 비교하였을 때 '설향'과 '육보' 딸기 품종의 당도가 각각 22.2%, 11.5% 향상되었다. 또한 엽면처리구의 '설향'과 '육보' 딸기 품종의 부패율은 무처리구에 비해 각각 63.8%와 74.4% 감소하였다. 엽채류인 상추, 케일, 붉은 케일, 흰 케일, 비트의 엽색 변화 및 백화현상이 저온저장 10일 후 물만 분무 처리한 무처리에서 관찰되었다. 그러나 25% C. vulgaris 배양액을 엽면 처리한 엽채류를 $4^{\circ}C$에서 저장하는 동안 부패율이 무처리에 비해 현저히 감소하였다.

솔나리 기내배양 및 재분화 식물체의 토양순화 (In vitro Culture and Acclimatization of Regenerated Plants of Liliem cernum $K_{OMAROV}$)

  • 김희규;임정대;현태경;이현용;이진하;유창연
    • 한국약용작물학회지
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    • 제9권4호
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    • pp.310-317
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    • 2001
  • 1. Bulb 유래 식물체 재분화는 식물생장조절물질이 첨가되지 않은 1/4MS 액체 배지에서 잎과 뿌리분화 및 생장, bulb 분화가 양호하였다. 2. 캘러스 현탁배양의 경우 2,4-D 1mg/ l 를 처리한 액체배지는 배발생 캘러스를 증가하였다. 식물생장조절제가 처리되지 않은 액체배지는 캘러스가 활성을 잃었고, 활성 감소는 salt strength가 감소함에 따라 급격히 감소하였다. 그리고 생장조절제가 처리되지 않는 액체배지에서 소수의 캘러스로부터 잎의 분화가 관찰되었다. 3. 솔나리 잎, 뿌리, 인편 중 재분화 식물체 유도는 인편이 가장 적합하며, 인편을 치상하였을 때, 잎의 분화는 MS 기본 배지에 NAA 1mg/ l 첨가와 1.5%의 sucrose 첨가한 곳에서 가장 양호하였다. 잎의 생장은 MS 기본 배지에 NAA 1mg / l를 첨가와 3.0%의 sucrose를 처리한 곳에서 관찰되었다. 뿌리의 분화 및 생장, 인편의 분화는 MS기본 배지에 NAA 1mg / l 를 첨가와 6%의 sucrose를 첨가한 배지에서 가장 양호함을 나타내었다. 4. 고체배지에서 잎의 분화는 spermidine에 비해 spermine첨가가 효과적이었고, 잎의 신장은 spermidine처리가 보다 효과적이었다. 뿌리의 분화 및 생장은 spermine처리에 의해 양호한 결과를 나타내었고, 인편의 분화는 spermidine첨가에서만이 나타났다. 액체배지에서 spermine과 spermidine 1mg/ l 를 처리하였을 때 잎, 뿌리 모두 분화하였다. Spermine 1mg/ l 를 첨가한 한 플라스크에서는 체세포 배 발생 이 관찰되었는데, 이는 2, 4-D 1mg/ l 를 처리한 액체배지에서 나타나는 것과 유사함을 나타내었다. 솔나리 인편배양에서 polyamine의 처리는 액체배지보다 고체배지가 효과적이었다. 5. 솔나리 인편배양을 통해 분화된 식물체의 토양순화 실험에서, 재분화된 식물체의 생존률은 vermiculite + perlite (1 : 1 by volume)에서 96.3%를 나타내어 가장 양호한 결과를 얻었고, 순화된 식물체의 뿌리 생장은 peat moss에서 가장 양호하였다.

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장티푸스환자의 혈청내 Salmonella typhi에 대한 IgG subclass항체의 분포 (Measurement of the Levels of IgG Subclasses Reactive to Salmonella typhi in the Sera of Patients with Typhoid Fever)

  • 김영중;황응수;강재승;차창룡;장우현;김윤원;조민기;민창홍
    • 대한미생물학회지
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    • 제21권4호
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    • pp.447-453
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    • 1986
  • To diagnose the typhoid fever rapidly and accurately in clinically suspected patients, the levels of IgG subclass antibody were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). With symptom, blood culture and agglutination test, tested persons were categorized into 6 groups as typhoid fever, FUO, paratyphi A or B, other bacterial infctions, cancers, and control. ELISA was performed on the polyvinyl chloride plates coated with killed whole cell($10^8\;cell/ml$) of S. typhi 0901W by poly-L-lysine applied as binding substance (and polyvinyl chloride as solid phase). The distribution of the level of IgG subclass antibodies in each group was analyzed and compared with other groups. The results obtained were summarized as follow: 1. The optimal dilution of the sera from patients with typhoid fever was 1:160, and those of the sheep anti-human IgG subclass and the peroxidase conjugated rabbit anti-sheep IgG were 1:4000 and 1:5000, respectively. 2. The absorbance levels of IgG subclass in the sera of typhoid fever patients were as follows; a) IgG1 value is $0.439{\pm}0.110$ b) IgG2 value is $0.416{\pm}0.165$ c) IgG3 value is $0.449{\pm}0.145$ d) IgG4 value is $0.525{\pm}0.154$ IgG subclass levels in the sera of typhoid patients were much higher than in control group and patient with paratyphi A or B as well as other infectious diseases. The sensitivity and the specificity in differential diagnosis of typhoid fever and other febrile diseases were 92% and 79% in the assay of IgG1 respectively, whereas those in the assay of IgG2 were 97% and 72%, respectively (above absorbance 0.3). 3. The absorbance levels of IgG subclass in the serial sera of typhiod fever patients tend to decrease to the level of absorbance 0.3 in 10 months from the onset of illness. 4. The order of absorbance levels of IgG subclass in the serum of each group were typhoid fever, paratyphi A or B, other infectious diseases, control and cancer. 5. For the serodiagnosis of typhoid fever against other febrile diseases, the sensitivity and the specificity in the assay of IgG2 activity were 76% and 93% in absorbance 0.4, respectively. 6. In the distribution of the level of each IgG subclass in the sera of FUO patients which were suspected of typhoid fever, the positive rate was ranged from 36% to 82%. This suggest that more than 50% of FUO patients are caused by S. typhi.

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한외여과 농축유로 제조한 모짜렐라 치즈의 일반성분 조성에 관한 연구 (General Composition of Mozzarella Cheese Made from Concentrated Milk Derived by Ultrafiltration)

  • 천정환;박준호;이종익;송광영;김동현;김홍석;현지연;서건호
    • Journal of Dairy Science and Biotechnology
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    • 제30권1호
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    • pp.55-67
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    • 2012
  • 본 연구는 한외여과를 이용하여 제조한 모짜렐라 치즈와 전통적인 방법에 의해서 제조한 치즈의 일반성분을 비교 분석 평가하여 경제적으로 개선된 모짜렐라 치즈를 제조하는 데 그 목적이 있다. 한외여과에 의해서 농축액의 지방, 단백질, 무지고형분(SNF) 함량이 원료유보다 높았으며, 한외여과의 농축계수만큼 증가하였지만(p<0.05), 유당에서는 유의 차가 없었다. 세균수에는 원료유와 농축액 모두 영향을 받지 않았다. 유청성분 중 단백질, 유당, 무지고형분은 처리구가 대조구보다 높았으며(p<0.05), 스타터 균주와 렌넷 첨가량에 따라서 유의차를 나타났지만, 세균수에 의해서 유청성분은 영향을 받지 않았다. 모짜렐라 치즈의 일반성분 분석 중 총 고형분은 지방 함량이 낮을수록 총 고형분 함량은 낮게 나타났다. 저장 기간 동안 총 고형분은 증가하는 경향을 보였다. 회분은 대조구와 처리구 및 저장기간과는 유의차가 없었다. 세균수와 유지방 함량 사이에서는 어떠한 유의차도 나타나지 않았고, 스타터와 렌넷의 첨가량도 회분에는 영향을 주지 않았다. 저장 기간 동안 거의 일정한 값을 보였다. 세균수와 지방 함량 의해 지방에 영향을 주었으며 (p<0.05), 스타터와 렌넷의 첨가량에 따라서 대조구와 처리구, CF 2, CF 3 그리고 첨가량이 50%, 65% 그리고 80%일때도 각각 유의차를 나타내었다(p<0.05). 저장 기간 동안 지방은 감소하는 경향을 보였다. 유당은 스타터와 렌넷의 첨가량에 따라 유의차가 있었고, 저장 기간 동안 감소하는 경향을 보였다. 단백질은 스타터와 렌넷의 첨가량에 따라 CF 2와 CF 3 사이에서만 유의차가 있었고(p<0.05), 저장 기간동안 감소하는 경향을 보였다. 수용성 질소화합물도 유지방 함량에 상관없이 세균수, 스타터와 렌넷의 첨가량에 따라 영향을 받으며(p<0.05), 저장 기간 동안 증가하는 경향을 보였다. 비단백태 질소화합물은 저장기간에 영향을 받으며, 저장기간 동안 증가하였다. 식염(NaCl)은 저장 기간 동안 증가하며, 스타터와 렌넷의 첨가량에 영향을 받았다.

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유산균의 배양물로부터 분리된 물질에 대한 암 유발 ICR Mice의 항암 효과 (Antitumor Activity of CBT-AK5 Purified from Lactobacillus casei against Sarcoma-180 Infected ICR Mice)

  • 여문환;김동명;김용환;김정화;백홍;정명준
    • Journal of Dairy Science and Biotechnology
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    • 제26권2호
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    • pp.23-30
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    • 2008
  • 최근 많은 관심을 가지는 유산균은 사람이나 동물의 장내 방어 장벽인 위산, 담즙산염, 췌장에 효과가 있고, 이들 생균은 장 점막에 쉽게 집락화하는 특성을 가지면서도 인체에는 무해한 균이기 때문에 식품첨가물 부분에서 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 분류되어 있고, 이런 안전성을 기반으로 수많은 제품이 제조되어 유통되고 있다. 유산균의 다양한 연구는 유산균 생균제, 사균체, 유산균 파쇄액을 이용하여 항암 효과, 유당 단백질의 흡수 증진, 콜레스테롤의 저하 류머티스 관절염 치료 및 정장작용 개선에 효과적인 기능을 가진다고 보고하고 있다. 이런 다양한 효과를 가지는 유산균의 기능을 이용하기 위하여 금번 연구에서는 항암 활성이 우수한 Lactobacillus casei의 2차 산물인 배양여액에서 순수 분리한 것으로 UItrafiltration membrane(3, 30 KDa)으로 분리 농축한 단백질 물질인 CBT-AK5을 실험에 사용하였다. 이전 연구로 CBT-AK5가 정상세포와 암세포주를 이용한 세포 독성 실험 및 암세포 생육 억제 활성을 측정한 결과, 정상세포에 대한 세포 독성은 20% 이내로 낮은 세포 독성 효과를 나타난 반면, 각 장기별 암세포주에 대한 암세포 생육 억제 활성을 측정한 결과 70% 이상의 높은 암세포 생육 억제 활성을 나타내어 항암 활성 물질임을 확인하였다. Lactobacillus casei의 2차 산물인 배양여액에서 순수 분리한 CBT-AK5의 항암 효과에 대한 in vivo 실험을 실시하였다. In vivo 실험으로 6~8주령된 ICR mice를 사용하였고, 복수암 유발 및 고형암 유발을 위해 Sarcoma-180 cell line이용하였다. 투여 방법으로는 경구투여와 복강내 투여로 나누어 진행하였고, 각 투여 방법에 따른 치료군과 예방군으로 나누어 실험하였다. 또한 치료군과 예방군마다 다른 농도별($25\;{\mu}g/m{\ell}$, $250\;{\mu}g/m{\ell}$, $2.5\;{\mu}g/m{\ell}$ 차이도 관찰하였다. 위 실험에서 경구투여에 따른 항암 활성 효과는 양성대조군보다 체중 증가와 생존율 비교에 있어서 정상군보다 다소 높게 관찰되었으나, In vitro 실험시 높은 항암 활성 효과에 비해 유의적이지 않았다. 하지만, 복강내 투여에 따른 항암 활성 효과는 양성대조군보다 체중 증가와 생존율 비교에 있어서 높은 활성 효과가 관찰되었고, 치료군과 예방군 모두에서 항암 활성이 우수한 물질임을 확인하였다. 이상의 실험에서 Lactobacillus casei의 2차 산물인 배양여액에서 순수 분리한 CBT-AK5가 항암 활성에 우수한 물질임을 확인하였다.

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표고버섯균사체의 사염화탄소 및 알콜로 처리된 흰쥐 간기능 보호 효과 (Mycelial Culture of Lentinus edodes Alleviates Rat Liver Toxicity Induced by Carbon Tetrachloride and Ethanol)

  • 하영래;김영숙;안채린;권정민;박철우;하영권;김정옥
    • 생명과학회지
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    • 제20권1호
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    • pp.133-141
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    • 2010
  • LED의 간 보호 기능을 연구하기 위하여 $CCl_4$ 및 ethanol로 SD rat에 간독성을 유발한 다음, LED를 처리하였다. LED의 간 기능 보호효과는 간장치료제인 Silymarin과 비교하였다. $CCl_4$로 간 독성을 유발한 경우, LED는간의 항산화효소인 SOD, catalase, GSH peroxidase 효소활성의 항진을 유도하였고, 산화물인 TBARS의 함량을 감소시켰다. 또한 간 손상의 지표인 혈장의 GOT, GPT 및 LDH의 활성을 감소시켰다. Ethanol로 간 독성을 유발한 경우 LED는 간의 SOD, catalase, GSH preoxidase 효소활성 및 GSH 함량을 항진시켰고, 총 cholesterol, triglyceride 및 TBARS의 함량을 감소시켰다. 또한 ethanol 대사에 관여하는 ADH 효소 활성을 증진시켰고, ROS 생성에 관여하는 CYP2E1 효소의 발현을 감소시킴으로써, 혈장의 GOT, GPT 및 LDH 효소활성이 감소되었다. 또한 LED는 DPPH 및 mouse liver mitochondrial system에서 항산화효과를 보였다. 이러한 결과로 미루어 볼 때 LED는 in vitro와 in vivo에서 항산화효과에 의한 간 기능 보호효과를 갖는 것으로 추정된다.

B형간염(型肝炎) 표면항원(表面抗原)의 주면역원(主免疫原) 결정기(決定基)에 특이(特異)한 합성(合成) Peptide의 면역원성(免疫原性)에 관한 연구(硏究) (Immunogenicity of Synthetic Peptide Specific for Major Immunogenic Determinat of Hepatitis B Surface Antigen)

  • 신광순;한수남
    • 대한수의학회지
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    • 제25권1호
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    • pp.7-17
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    • 1985
  • Many investigators have been pursuing various attempts so far to produce hepatitis B surface antigen(HBsAg) vaccines using the techniques such as isolation from plasma of chronic HBsAg carrier, recombinant DNA technique or preparation of synthetic peptides specific for immunogenic determinants. Hepatitis B virus can not grow on any cell lines by the tissue culture technique at the present time. The plasma of chronic HBsAg carrier is expensive and its source is limited. The HBsAg from the recombinant DNA technique gave still very low yield. Another approach, therefore, has been initiated to develop a synthetic hepatitis B virus vaccine. The possible use of several distinct synthetic vaccines in prophylaxis can be facilitated by availability of full synthetic immunogens. Peptides synthesized for potential application as antiviral vaccines have been mostly tested in the form of conjugates with carrier proteins, although the free synthetic peptide can be immunogenic. To understand basic knowledges on the antigenicity and immunogenicity of a synthetic peptide specific for major immunogenic determinant of HBsAg, a nonapeptide, $H_2N^{139}Cys-Thr-Lys-Pro-Thr-Asp-Gly-^{146}Asn-Aba$ COOH, which corresponds to HBsAg amino acid residues 139 to 147, was synthesized by the Merrifield's solid-phase method with a slight modification. The antigenicity and immunogenicity of this specific synthetic peptide were examined comparing with purified plasma-derived natural HBsAg. The results obtained are as follows; 1. The peptide synthesized showed the identical amino acid composition to the theoretical value. The degree of purification and molecular weight were acertained by methods of high performance liquid chromatography and mass spectrometry. 2. Using m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester as a conjugating agent, the synthetic peptide was conjugated to rabbit albumin and ${\gamma}$-globulin, tetanus and diphtheria toxoids, and keyhole limpet hemocyanin. Their conjugation yields were 8.3, 9.5, 15.8, 13.5, and 11.2%, respectively. 3. The natural HBsAg was purified from plasma of chronic HBsAg carrier. By the electron microscopic observation of the purified natural HBsAg preparation, no Dane particles were observed and the preparation showed negative DNA polymerase activity. 4. Antigenicity of the synthetic peptide and the plasma-derived natural HBsAg was determined by competition radioimmunoassay using $^{125}I$-natural HBsAg. Their 50% inhibitions appeared as $90{\mu}g/ml$ and $0.12{\mu}g/ml$ for the synthetic peptide and the natural HBsAg, respectively. This indicates that the former was about 750-fold less antigenic than the latter. 5. Immunogenicity of the synthetic peptide was determined by administering the peptide-carrier conjugates into rabbits with and without Freund's complete adjuvant. Regardless the carrier proteins and adjuvant, positive immune responses to the synthetic peptide were observed. The higher antibody titers, however, were shown in the groups administered with Freund's complete adjuvant. 6. Immunizing dose 50% in mice of the various peptide-carrier conjugates was 5.47, 6.00, 65.16, 31.25 and $13.03{\mu}g/dose$ for rabbit albumin and ${\gamma}$-globulin, tetanus and diphtheria toxoids, and keyhole limpet hemocyanin, respectively, while the natural HBsAg showed $0.65{\mu}g/dose$. 7. It was postulated that homologous proteins prefer to heterologous ones as the carriers.

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