자외선에 노출된 피부에서 생성된 활성산소종에 의한 산화적 스트레스는 세포 구성 성분들을 손상시키고 궁극적으로는 피부 광노화 및 발암을 야기시킬 수 있다. 이 연구에서는 대두(Glycine max MERRILL)의 성분인 genistein(4',5,7-trihydroxyisoflavone)을 포함하는 몇 가지 천연 황산화제들에 대하여 로즈벵갈로 증감된 사람 적혈구의 광용혈에 대한 보호효과를 조사하였다. Genistein$(10-100\;{\mu}M)$은 농도-의존적으로 광용혈을 억제하였다. 그리고 지질 과산화 연쇄반응의 차단제인 ${\alpha}$-tocopherol보다도 더 효과적이었다. 그러나, Genitein의 배당체인 genistin, 소용성 항산화제인 L-ascorbate, 철-킬레이트제인 sodium phytate는 광용혈에 대하여 보호 효과를 나타내지 않았다. 오히려 보다 높은 농도$(500\;{\mu}M)$에서는 L-ascorbate와 sodium phytate 모두 광용혈을 촉진시켰다. 반면, $^1O_2$ 소광제로 알려진, ${\alpha}$-carotene 3,3'-diol은 현저한 보호 효과를 보여주었다. 이 결과는 로즈벵갈로 증감된 광용혈에 있어서 $^1O_2$이 중요함을 가리킨다. Luminol-의존성 화학발광법을 이용하여, $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ 계에서 생성된 ROS에 대한 몇가지 천연 항산화제들의 ROS 소거활성을 측정하였다. 활성 산소 소거활성$(OSC_{50})$의 크기는 sodium phytate > L-ascorbate>${\alpha}$-tocopherol > genistein > genistin순이었다. Gnistein, genistin, ${\alpha}$-tocopherol, L-ascorbate 및 sodium phytate의 활성산소 소거활성$(OSC_{50})$은 각각 41.0, 109.0, 9.0, 5.2, 및 $0.56{\mu}M$이었다. Free radical 소거활성$(FSC_{50})$의 크기는 L-ascorbate > ${\alpha}$-tocopherol > genistein > genistin순으로 나타났다. 이상의 결과들은 genistein이 $^1O_2$ 혹은 다른 ROS를 소거함으로써 그리고 ROS에 대항하여 세포막을 보호함으로써 생체계, 특히 태양 자외선에 노출된 피부에서 항산화제로서 작용할 수 있음을 가리킨다.
할로겐화아렌이 다른 아렌에 etheral alkyl그룹에 의해 연결된 2-halobenzyl phenyl ether( 1과 2)를 합성하여 제조적인 광반응에서 생성물을 확인하고 또 속도론적 광반응에서 그 반응성을 시험하였다. 질소 기류 하에서 2-chlorobenzyl phenyl ether(1)은 페놀과 photo-Fries형 생성물이 나왔으며 Br치환 ether2는 페놀과 photo-Fries형 생성물 이외에 광고리화 및 광환원 생성물이 나왔다. 이것은 Cl이 benzyl고리에 강하게 붙어 있기 때문에 상대적으로 약한 $CH_{2}-O$결합의 파열이 생긴 결과이다. 또 Br유도체 2는 phenyl-bromine 사이의 결합이 phenyl-chlorine사이의 결합보다 약하니까 결국 그 결합의 광유발 파열이 $CH_{2}-O$결합 파열과 경쟁적으로 되었음이 분명하다. 산소 존재하에서 페놀의 생성은 큰 변화가 없고, photo-Fries형 생성물은 약간 감소하고 , 그리고 광고리화 생성물과 광환원 생성물은 큰 영향을 받는 것으로 보아 광고리화와 환원반응은 삼중상태가 상관하고 photo-fries형 반응은 단일상태와 삼중상태가 동시에 상관하는 것이다.
인체 백혈구에서 추출한 myeloperoxidase(MPO)에 의한 NADH산화 및 methional에서의 ethylene 생성을 관찰하여 cell-free MPO/$H_2O_2/Cl^-$ system에서 관여하는 oxygen metabolites가 무엇인지를 규명하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 1) NADH는 MPO/$H_2O_2/Cl^-$에 의하여 산화됨을 확인하였다. 즉 MPO, $H_2O_2$ 및 $Cl^-$가 존재하는 medium에서 NADH의 산화는 azide와 catalase에 의하여, 그리고 medium에서 $Cl^-$를 제거하였을 때 완전히 제거되었다. 2) 이와같은 MPO/$H_2O_2/Cl^-$에 의한 NADH산화는 $^1O_2$ 제거물질인 1,4-diazabicyclo(2,2,2) octane(DABCO)에 의하여 완전히 억제 되었으나 $OH{\cdot}$의 제거물질인 mannitol, benzoate, formate 및 methanol에 의해서는 영향을 받지 아니하였다. 3) 또한 methinal을 MPO/$H_2O_2/Cl^-$으로 처리하였을 때는 ethylene이 전혀 검출되지 아니하였으나 기타 $OH{\cdot}$을 생성할 것으로 알려진 산화계인 xanthine/xanthine oxidase 및 $Ca^{++}-H_2O_2$에 의해서는 현저한 ethylene생성을 관찰하였다. 이상의 결과는 Cell-free MPO/$H_2O_2/Cl^-$ 산화계에서는 $^1O_2$이 산화반응에 관여하는 주된 산소 대사물이며 $OH{\cdot}$은 생성되지 아니함을 알 수 있었다.
항균제 nitrofurantion에 의한 폐독작용의 생화학적 기전을 규명하기 위한 연구 일환으로 in vitro에서 폐장 microsome 지질의 과산화 및 반응성 산소 radical $(O^{-}_{2}{\cdot},\;H_2O_2,\;OH{\cdot},\;^1O_2)$의 생성에 대한 nitrofurantion의 영향과 양자 간의 상호 관련성을 검토하였다. Nitrofurantion은 호기성 반응 조건에서 돼지 폐장 microsome의 NADPH 의존성 지질 과산화를 용량 의존적으로 증가시킬 뿐 아니라 $O^{-}_{2}{\cdot},\;H_2O_2$ 및 두 radical의 상호 작용으로 2차적으로 형성되는 $OH{\cdot}$의 생성 또한 촉진하였으며 $^1O_2$생성은 관찰되지 않았다. 이와 같은 폐장 microsome지질 과산화 증가는 SOD 및 catalase에 의하여 억제될 뿐만 아니라 $OH{\cdot}$ 제거 물질인 mannitol, thiourea에 의하여도 현저히 억제되었으며, $^1O_2$ 제거 물질에 의하여는 영향을 받지 않았던 한편 염기성 반응 조건에서는 nitrofurantoin에 의한 지질 과산화가 관찰되지 않았다. 이상의 결과로 미루어 보아 nitrofurantoin은 폐장 microsome의 NADPH 의존적이 반응성산소 radical $(O^{-}_{2}{\cdot},\;H_2O_2$ 및 $OH{\cdot})$의 생성을 증가시키며 이들 중 특히 $OH{\cdot}$ 에 의한 microsome막 지질 과산화를 촉진하는 것으로 결론지었고, 이와 같은 in vivo 현상은 nitrofurantion의 in vitro 폐독작용의 기전을 설명하는 일부가 될 것으로 사료하였다.
시판 혼합조미료(SS-1, SS-2)를 시료로 하여 조사선원(감마선, 전자선) 및 조사선량(0-20 kGy)에 따른 ESR spectrum의 특성을 비교하고, 방사선조사 유래의 signal에 대한 parameter를 분석하여 조사여부 판별을 뒷받침하는 자료를 확인하였다. 그 결과, 방사선 조사된 조미료 시료에서는 조사선원에 상관없이 특이한 free radical의 ESR signal을 보여주었다. 이 signal은 g-value가 2.031, 2.021, 2.017, 2.009, 2.002, 1.990 및 1.980인 크고 작은 7개의 peak를 지닌 crystalline sugar 유래의 multicomponent radical로 확인되었다. 그러나 방사선 처리되지 않은 두 시료(SS-1, SS-2)는 모두 매우 낮은 강도의 singlet line의 형태의 spectrum을 나타내어 비조사구와 조사구의 구별이 분명하였다. 조사선원과 선량에 따른 signal intensity를 비교한 결과, 동일한 측정조건에서 모든 조사선량에서 전자선 시료가 감마선시료보다 더 높은 강도를 나타내었으며, 조사선량의 증가에 따라 선형적으로 증가하였다($R^2=0.9916{\sim}0.9973$). 두 시료에서 방사선 조사 유래의 spectra는 조사선원 및 조사선량에 관계없이 g-value와 signal을 나타내는 자장영역은 거의 일정하였으며, 주요 signals($g_2=2.021$, $g_4=2.009$, $g_5=2.002$, $g_6=1.990$)의 강도 역시 조사선량에 따라 증가하였다($R^2=0.8243{\sim}0.9929$).
섬유소 식품 중 바질과 정향의 방사선 조사처리 여부 확인을 위한 전자스핀공명분석법(ESR)의 개선을 위해 동결건조(FD), 상압건조(OD), 알코올건조(AE), 알코올세척건조(WAE) 처리하여 cellulose radical을 확인하였다. 비 조사 시료는 모두 singlet signal($g_0$=2.006)을 나타내었고, 조사된 시료의 경우는 모두 singlet signal을 중심으로 두 개의 side peak($g_1$=2.023 and $g_2$=1.986)가 6 mT 간격으로 나타나 cellulose 유래의 signal을 확인할 수 있었다. AE, WAE 처리한 정향의 경우, 조사유래의 cellulose radical의 ESR intensity가 증가하였으며, central peak와 side peak의 비율도 판별에 매우 적합하였다. 그러나 FD 처리한 바질의 경우 ESR intensity는 가장 크게 나타났으나, signal ratio는 AE, WAE 처리하였을 때 더 이상적이었다. 또한 $Mn^{2+}$ signal 유래의 radical은 AE, WAE 처리한 시료에서 크게 감소하여, FD 및 OD에 비해 매우 명확한 조사여부 판별이 가능하였다. 따라서 AE, WAE 처리는 바질과 정향의 조사여부 판별방법을 크게 개선시키는 것으로 확인되었으며, 기타 향신료에 대해서도 ESR spectra 분석에 적용 가능할 것으로 판단되었다.
지질산화생성물에 의한 DNA손상작용 및 그 억제 기구를 밟히기 위하여 linoleic acid와 plasmid DNA와의 모델계를 통하여 검토하였는데, 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. Linoleic acid의 산화에 의하여 DNA가 손상되었으며, 그 정도는 linoleic acid의 양이 많을 수록 크게 나타났다. 2. Linoleic acid의 산화에 의한 DNA손상작용은 POV 100 mea/kg이하인 산화초기에서도 빠르게 진행되었다. 산화초기의 DNA손상작용에는 활성산소 종의 관여가 크게 나타났는데, 그 중에서도 일중항 산소와 superoxide anion의 영향이 큰 것으로 나타났다. 3. 지질 2차반응생성물인 malonaldehyde와 hexanal의 DNA손상작용은 linoleic acid경우와는 달리 활성산소종과는 무관하였으며 DNA와 와의 복합체형성에 의하였다. 4. Linoleic acid hydroperoxide의 DNA 손상작용은 linoleic acid의 초기신화에 의한 DNA손상작용 보다 크게 나타났고, 활성산소종의 영향은 없었다. 5. 지진산화생성물에 의한 DNA손상 작용은 천연 항산화성분(마늘 및 생강추출물) 및 활성산소소거제($\alpha-tocopherol 및 superoxide dismutase$의 첨가에 의하여 크게 억제되었다. 특히 . 마늘 및 생강추출물은 활성산소종의 생성을 비롯하여 공액 diene 및 POV의 증가 또한 크게 억제하였다.
고도불포화지방산함량이 많은 적색육어류지질의 산화에 의한 DNA 손상작용기구를 조사하기 위하여 고등어를 시료로 하여 추출한 지질을 plasmid pBR 322DNA와 $37^{\circ}C$에서 반응시켜 경시적인 DNA 손상정도를 조사하였으며 이와 함께 지질과 DNA의 반응계에 각종 활성산소소거제를 일정농도씩 첨가하고 지질산화로 일어나는 DNA 손상에 대한 활성산소종의 영향을 비교${\cdot}$ 검토하였다. 고등어 지질의 농도가 클수록 DNA 손상작용이 컸으며 이러한 작용은 고등어 지질의 POV가$100millieq{\cdot}/kg$이하에서 진행된 것으로 나타났다. 또한 활성산소종중 일중항산소$(^1O_2)$와 superoxide anion$({\cdot}O_2^-)$ DNA 손상작용이 가장 컸으며 수산 radical과 과산화 수소는 반응1일이후 거의 영향을 미치지 않아 반응초기의 DNA 손상작용에 관여할 것으로 생각된다. 또한, 고등어 지질의 산화에 대한 활성산소종의 영향을 살펴 본 결과, DNA 손상에 대한 결과와 마찬가지로 일중항산소와 superoxide anion의 영향이 큰 것으로 보아 고등어 지질의 산화반응이나 DNA 손상작용에 있어서 활성산소종이 밀접한 관계가 있는 것으로 나타났다.
본 연구에서는 그라비올라의 주성분인 nicotiflorin을 분리하고 그 아글리콘 성분인 kaempferol을 얻어 세포 보호 효과 및 그 보호 메커니즘을 규명하였다. L-Ascorbic acid 및 (+)-${\alpha}$-tocopherol을 대조군으로 하여, $^1O_2$로 유도된 세포 손상에 대해 nicotiflorin 및 kaempferol의 보호 효과를 측정한 결과 nicotiflorin < (+)-${\alpha}$-tocopherol < kaempferol 순으로 보호 효과가 증가하였다. L-Ascorbic acid는 세포 보호 효과를 보이지 않았다. 이들의 세포 보호 효과 메커니즘을 밝히기 위해 singlet oxygen 소광 속도 상수, 자유라디칼 소거 활성, ROS 소거 활성 및 적혈구 세포 침투율을 측정하였다. 실험 결과, kaempferol과 그 배당체인 nicotiflorin의 세포 보호 효과에 있어서 큰 차이는 세포막에의 침투가 가장 큰 요인으로 확인되었다. 대조군 L-ascorbic acid가 항산화능은 크지만 실험 조건에서 세포막에 침투가 잘 안되어 세포 보호 효과가 나타나지 않은 것으로 확인되었다. Kaempferol과 (+)-${\alpha}$-tocopherol의 비교를 통해 세포 침투뿐만 아니라 라디칼 소거활성 및 ROS 소거 활성도 세포 보호 효과에 기여하는 것으로 나타났다. 결론적으로, 광증감 반응으로 유도된 세포막 파괴에 대한 보호작용은 항산화제들의 세포 침투, 자유라디칼 및 ROS 소거 활성이 큰 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
Collagen은 세포 외에 존재하며, 분자의 수명이 매우 긴 단백질이므로, 노화와 관련된 비효소적 당화의 대상으로 많은 관심이 모아지고 있다. 본 연구에서는 진피 collagen의 비효소적 당화와 분해 및 가교결합에 대한 자외선(UVA)과 활성산소종들의 영향을 검토하였다. 암소 피부로부터 얻은 collagen 과 glucose의 혼합물에 몇가지 활성산소 소거제를 첨가하고 UVA를 조사하여 비효소적 당화, 단백질 분해, 가교결합의 정도를 관찰하였다. 비효소적 당화는 자외선에 의해 증가되지 않았으며, 수퍼옥사이드 라디칼과 일중항 산소의 소거제에 의해서는 감소하였으나, 히드록시 라디칼 소거제에 의해서는 변화가 없었다. 단백질 분해와 가교결합은 자외선에 의해 증가되었으며, 분해는 세가지 활성산소의 소거제 모두에 의해 감소되었으나, 가교결합은 특히 히드록시 라디칼 소거제의 영향이 컸다. 즉 수퍼옥사이드 라디칼과 일중항 산소는 자외선과는 관계 없이 당의 자동산화에 의해 발생되어 당화로 인한 변화의 초기 단게에 관여하고, 반응의 뒷부분에서는 당단백질과 자외선에 의해 만들어진 히드록시 라디칼이 주된 역할을 하고 있다. 상기의 결과로부터 활성산소종들과 자외선은 다른 조직 및 세포물질들을 손상시키듯이 노화와 관련된 collagen 변화를 증가시키는 것을 알 수 있었다. 이는 자외선 차단제와 함께 활성산소 소거 물질들을 외용도포하는 것이 태양광선의 해로운 영향으로부터 진피를 보호하는데 도움이 될 수 있음을 의미한다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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