Short interfering RNA(siRNA)는 특별한 gene의 발현을 막는데 사용될 수 있고 그 gene의 기능과 치료의 적용에 많은 가능성을 가지고 있지만, 효과적인 siRNA를 디자인하는 방법은 아직까지 명확하지 않다. 효과적인 siRNA는 서열적인 경향을 가지고 있는데 낮은 G/C content, Sense strand의 3' 끝에 적은 안정성과 1번 위치에는 G/C, 19번 위치에는 A/U의 존재 여부를 들 수 있다. 이러한 특성 말고도 최근에는 mRNA의 2차구조가 RNAi 작용에 중요한 역할을 하게 되는데 복잡한 구조(hairpin, multi loop)를 가지고 수소결합을 많이 하여 안정한 상태에 있는 부분은 siRNA의 기능을 크게 줄어들게 한다. 또한, siRNA가 특정한 mRNA에 작동하도록 BLAST 검색을 하여 부작용의 가능성을 배제한다.
Zhu, Xi-Shan;Lin, Zi-Ying;Du, Jing;Cao, Guang-Xin;Liu, Gang
Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
/
제15권12호
/
pp.4773-4780
/
2014
Background: To investigate the effects of small interference RNA (siRNA) targeting BCR/ABL mRNA on proliferation and apoptosis in the K562 human chronic myeloid leukemia (CML) cell line and to provide a theoretical rationale and experimental evidence for its potential clinical application for anti-CML treatment. Materials and Methods: The gene sequence for BCR/ABL mRNA was found from the GeneBank. The target gene site on the BCR/ABL mRNA were selected according to Max-Planck-Institute (MPI) and rational siRNA design rules, the secondary structure of the candidate targeted mRNA was predicted, the relevant thermodynamic parameters were analyzed, and the targeted gene sequences were compared with BLAST to eliminate any sequences with significant homology. Inhibition of proliferation was evaluated by MTT assay and colony-formation inhibiting test. Apoptosis was determined by flow cytometry (FCM) and the morphology of apoptotic cells was identified by Giemsa-Wright staining. Western blotting was used to analyze the expression of BCR/ABL fusion protein in K562 cells after siRNA treatment. Results: The mRNA local secondary structure calculated by RNA structure software, and the optimal design of specific siRNA were contributed by bioinformatics rules. Five sequences of BCR/ABL siRNAs were designed and synthesized in vitro. Three sequences, siRNA1384, siRNA1276 and siRNA1786, which showed the most effective inhibition of K562 cell growth, were identified among the five candidate siRNAs, with a cell proliferative inhibitory rate nearly 50% after exposure to 12.5nmol/L~50nmol/L siRNA1384 for 24,48 and 72 hours. The 50% inhibitory concentrations ($IC_{50}$) of siRNA1384, siRNA1276 and siRNA1786 for 24hours were 46.6 nmol/L, 59.3 nmol/L and 62.6 nmol/L, respectively, and 65.668 nmol/L, 76.6 nmol/L, 74.4 nmol/L for 72 hours. The colony-formation inhibiting test also indicated that, compared with control, cell growth of siRNA treated group was inhibited. FCM results showed that the rate of cell apoptosis increased 24 hours after transfecting siRNA. The results of annexinV/PI staining indicated that the rate of apoptosis imcreased (1.53%, 15.3%, 64.5%, 57.5% and 21.5%) following treamtne with siRNAs (siRNA34, siRNA372, siRNA1384, siRNA1276 and siRNA1786). Morphological analysis showed td typical morphologic changes of apoptosis such as shrunken, fragmentation nucleus as well as "apoptotic bodies" after K562 cell exposure to siRNA. Western blot analysis showed that BCR/ABL protein was reduced sharply after a single dose of 50nmol/L siRNA transfection. Conclusions: Proliferation of K562 cells was remarkbly inhibited by siRNAs (siRNA1384, siRNA1276 and siRNA1786) in a concentration-dependent manner in vitro, with effective induction of apoptosis at a concentration of 50 nmol/L. One anti-leukemia mechanism in K562 cells appeared that BCR/ABL targeted protein was highly down-regulated. The siRNAs (siRNA1384, siRNA1276 and siRNA1786) may prove valuable in the treatment of CML.
Background: To investigate the influence of telomerase activity, apoptosis, radiosensitivity of cervical cancer after siRNA-mediated knockdown of telomerase RNA and evaluate in vivo growth with gene interference. Methods: We studied siRNA-targeting-telomerase RNA transfection into the Hela cell line. Expression of hTERC mRNA was detected by RT-PCR and telomerase activity was measured by the TRAP assay. Growth inhibition was determined by MTT assay and radiosensitivity of the cervical cancer cells was examined by colony formation assay. In addtion, effects of hTERC inhibition in vivo were studied by injection of siRNA-transfected Hela cells into nude mice. Results: The hTERC siRNA effectively downregulated the expression of hTERC mRNA and also reduced the telomerase activity to 30% of the untreated control vlaue. The viability of hTERC siRNA transfected Hela cells was reduced by 44.7% after transfection. After radiation treatment, the radiosensitivity of Hela cells with hTERC knockdown was increased. In vivo, the tumors developing from the hTERC siRNA-transfected cells were of reduced size, indicating that the hTERT siRNA also depressed the tumorigenic potential of the Hela cells. Conclusions: Our results supported the concept of siRNA-mediated inhibition of telomerase mRNA which could inhibit the expression of hTERC and telomerase activity. Furthermore, radiosensitivity was upregulated after knockdown the hTERC in vivo and in vitro.
Small interfering RNA (siRNA) functions through pairing with specific mRNA sequences and results in the mRNA's degradation. It is a potential therapeutic approach for many diseases caused by altered gene expression. The delivery of siRNA is still a major problem due to its rapid degradation in the circulation. Various strategies have been proposed to help with the cellular uptake of siRNA and short or small hairpin RNA (shRNA). Here, we reviewed recently published data regarding local applications of siRNA. Compared with systemic delivery methods, local delivery of siRNA/shRNA has many advantages, such as targeting the specific tissues or organs, mimicking a gene knockout effect, or developing certain diseases models. The eye, brain, and tumor tissues are 'hot' target tissues/organs for local siRNA delivery. The siRNA can be delivered locally, in naked form, with chemical modifications, or in formulations with viral or non-viral vectors, such as liposomes and nanoparticles. This review provides a comprehensive overview of RNAi local administration and potential future applications in clinical treatment.
Small interfering synthetic double-stranded RNA (siRNA) was applied to suppress the expression of the human cytotoxic-T-Iymphocyte antigen 4-immunoglobulin (hCTLA4Ig) gene transformed in transgenic rice cell cultures. The sequence of the 21-nucleotide siRNA was deliberately designed and synthesized with overhangs to inactivate the expression of hCTLA4Ig. The chemically synthesized siRNA duplex was combined with polyethyleneimine (PEl) at a mass ratio of 1:10 (0.33 ${\mu}g$ siRNA:3.3 ${\mu}g$ PEl) to produce complexes. The siRNA complexes (siRNA+PEI) were labeled with Cy3 in order to subsequently confirm the delivery by fluorescent microscopy. In addition, the cells were treated with sonoporation at 40 kHz and 419W for 90 s to improve the delivery. The siRNA complexes alone inhibited the expression of hCTLA4Ig to 45% compared with control. The siRNA complexes delivered with sonoporation downregulated the production of hCTLA4Ig to 73%. Therefore, we concluded that the delivery of siRNA complexes into plant cells could be enhanced successfully by sonoporation.
Kim, Ji Young;Choung, Sorim;Lee, Eun-Ju;Kim, Young Joo;Choi, Young-Chul
Molecules and Cells
/
제24권2호
/
pp.247-254
/
2007
Improvement in the pharmacokinetic properties of short interfering RNAs (siRNAs) is a prerequisite for the therapeutic application of RNA interference technology. When injected into mice as unmodified siRNAs complexed to DOTAP/Chol-based cationic liposomes, all 12 tested siRNA duplexes caused a strong induction of cytokines including interferon ${\alpha}$, indicating that the immune activation by siRNA duplexes is independent of sequence context. When modified by various combinations of 2'-OMe, 2'-F, and phosphorothioate substitutions, introduction of as little as three 2'-OMe substitutions into the sense strand was sufficient to suppress immune activation by siRNA duplexes, whereas the same modifications were much less efficient at inhibiting the immune response of single stranded siRNAs. It is unlikely that Toll-like receptor 3 (TLR3) signaling is involved in immune stimulation by siRNA/liposome complexes since potent immune activation by ds siRNAs was induced in TLR3 knockout mice. Together, our results indicate that chemical modification of siRNA provides an effective means to avoid unwanted immune activation by therapeutic siRNAs. This improvement in the in vivo properties of siRNAs should greatly facilitate successful development of siRNA therapeutics.
BACKGROUND: Collagen organization within tissues has a critical role in wound regeneration. Collagen fibril diameter, arrangements and maturity between connective tissue growth factor (CTGF) small interfering RNA (siRNA) and mismatch scrambled siRNA-treated wound were compared to evaluate the efficacy of CTGF siRNA as a future implement for scar preventive medicine. METHODS: Nanocomplexes of CTGF small interfering RNA (CTGF siRNA) with cell penetrating peptides (KALA and $MPG^{{\Delta}NLS}$) were formulated and their effects on CTGF downregulation, collagen fibril diameter and arrangement were investigated. Various ratios of CTGF siRNA and peptide complexes were prepared and down-regulation were evaluated by immunoblot analysis. Control and CTGF siRNA modified cells-populated collagen lattices were prepared and rates of contraction measured. Collagen organization in rabbit ear 8 mm biopsy punch wound at 1 day to 8 wks post injury time were investigated by transmission electron microscopy and histology was investigated with Olympus System and TS-Auto software. CONCLUSION: CTGF expression was down-regulated to 40% of control by CTGF siRNA/KALA (1:24) complexes (p<0.01) and collagen lattice contraction was inhibited. However, down-regulated of CTGF by CTGF $siRNA/MPG^{{\Delta}NLS}$ complexes was not statistically significant. CTGF KALA-treated wound appeared with well formed-basket weave pattern of collagen fibrils with mean diameter of $128{\pm}22nm$ (n = 821). Mismatch siRNA/KALA-treated wound showed a high frequency of parallel small diameter fibrils (mean $90{\pm}20nm$, n = 563). CONCLUSION: Controlling over-expression of CTGF by peptide-mediated siRNA delivery could improve the collagen orientation and tissue remodeling in full thickness rabbit ear wound.
Kim, Eun-Joong;Kim, Young-Bong;Choi, Han-Gon;Shim, Chang-Koo;Oh, Yu-Kyoung
Journal of Pharmaceutical Investigation
/
제35권5호
/
pp.343-348
/
2005
Recently, siRNA has been emerging as new therapeutic agents for various diseases such as cancers and infectious diseases. However, the evaluation for delivery systems for siRNA has not been fully done. In this study, we designed and delivered siRNA of oncogenic E6 and E7 proteins to several cell lines and tested the delivery efficiencies of various cationic nonviral delivery vectors. Of cationic delivery systems tested in this study, lipid-based Lipofectamine revealed higher delivery efficiency of siRNA to cervical cancer cell line, SiHa, compared to other delivery systems. Notably, the polyethylenimine, which showed the comparable delivery efficiencies in plasmid DNA, did not show significant delivery of siRNA in cervical cancer cells. These results indicate that the mechanisms involved in siRNA delivery might be different from those in plasmid DNA delivery, and that cationic lipid-based delivery vehicles deliver siRNA with higher efficiency to intracellular target sites.
본 연구는 siRNA 기반 치료제등의 핵산치료제 개발에 있어서 필수적인 약물의 생체내 흡수, 분포, 대사, 배설에 대한 동태의 확인을 위해 stem-loop RT-qPCR 법을 이용하여 보다 더 정확한 시험법을 확립하고자 하였다. siRNA에 특이적인 primer와 probe를 선별하여 siRNA 정량검출 시험법을 최적화하였다. siRNA 표준시료를 이용하여 최적화된 시험법을 적용하였을 때 siRNA 표준시료에 대한 Cp 값(y)간의 선형분석 결과, 기울기 평균 -3.3, 결정계수 $R^2$>0.99으로 확인되어 siRNA 표준시료와 Cp 값 간의 회귀성이 매우 높아 정량 분석이 가능한 시험법임을 확인하였고, 같은 표준시료를 이용한 stem-loop RT-qPCR의 검출한계(LOD)는 10 fM, 최소정량한계(LLOQ)는 100 fM이었다. 확립된 시험법의 신뢰성을 확인하기 위해 시험자를 다르게 하고, 시험법을 3회 반복하여 각각 진행한 결과, siRNA 표준시료에 대한 Cp 값(y)간의 선형분석 결과 기울기와 결정계수 $R^2$의 재현성(slope ${\pm}-3.2$, 결정계수 $R^2$>0.99)을 확인하였고, 표준 곡선으로부터 환산된 siRNA 표준시료의 회수율(recovery ${\pm}20%$)과 완건성이 우수함을 확인하였다. 확립된 stem-loop RT-qPCR을 생체내 존재하는 약물 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 시험동물에 siRNA를 주입 후 시간별 혈액을 채취하여 확립된 시험법으로 시험을 진행하였고 약물 동태학적 분석을 통해 siRNA치료제의 혈액내의 안정성을 확인하였다. 따라서 본연구에서 개발된 stem-loop RT-qPCR 분석법은 정확성, 정밀성 및 민감도가 높은 분석법으로 핵산치료제 개발 연구의 다양한 생체시료 분석 연구에 적용할 수 있을 것으로 기대한다.
Hartawan, Risza;Pujianto, Dwi Ari;Dharmayanti, Ni Luh Putu Indi;Soebandrio, Amin
Journal of Veterinary Science
/
제23권2호
/
pp.24.1-24.10
/
2022
Background: Small interfering RNA technology has been considered a prospective alternative antiviral treatment using gene silencing against influenza viruses with high mutations rates. On the other hand, there are no reports on its effectiveness against the highly pathogenic avian influenza H5N1 virus isolated from Indonesia. Objectives: The main objective of this study was to improve the siRNA design based on the nucleoprotein gene (siRNA-NP) for the Indonesian H5N1 virus. Methods: The effectiveness of these siRNA-NPs (NP672, NP1433, and NP1469) was analyzed in vitro in Marbin-Darby canine kidney cells. Results: The siRNA-NP672 caused the largest decrease in viral production and gene expression at 24, 48, and 72 h post-infection compared to the other siRNA-NPs. Moreover, three serial passages of the H5N1 virus in the presence of siRNA-NP672 did not induce any mutations within the nucleoprotein gene. Conclusions: These findings suggest that siRNA-NP672 can provide better protection against the Indonesian strain of the H5N1 virus.
본 웹사이트에 게시된 이메일 주소가 전자우편 수집 프로그램이나
그 밖의 기술적 장치를 이용하여 무단으로 수집되는 것을 거부하며,
이를 위반시 정보통신망법에 의해 형사 처벌됨을 유념하시기 바랍니다.
[게시일 2004년 10월 1일]
이용약관
제 1 장 총칙
제 1 조 (목적)
이 이용약관은 KoreaScience 홈페이지(이하 “당 사이트”)에서 제공하는 인터넷 서비스(이하 '서비스')의 가입조건 및 이용에 관한 제반 사항과 기타 필요한 사항을 구체적으로 규정함을 목적으로 합니다.
제 2 조 (용어의 정의)
① "이용자"라 함은 당 사이트에 접속하여 이 약관에 따라 당 사이트가 제공하는 서비스를 받는 회원 및 비회원을
말합니다.
② "회원"이라 함은 서비스를 이용하기 위하여 당 사이트에 개인정보를 제공하여 아이디(ID)와 비밀번호를 부여
받은 자를 말합니다.
③ "회원 아이디(ID)"라 함은 회원의 식별 및 서비스 이용을 위하여 자신이 선정한 문자 및 숫자의 조합을
말합니다.
④ "비밀번호(패스워드)"라 함은 회원이 자신의 비밀보호를 위하여 선정한 문자 및 숫자의 조합을 말합니다.
제 3 조 (이용약관의 효력 및 변경)
① 이 약관은 당 사이트에 게시하거나 기타의 방법으로 회원에게 공지함으로써 효력이 발생합니다.
② 당 사이트는 이 약관을 개정할 경우에 적용일자 및 개정사유를 명시하여 현행 약관과 함께 당 사이트의
초기화면에 그 적용일자 7일 이전부터 적용일자 전일까지 공지합니다. 다만, 회원에게 불리하게 약관내용을
변경하는 경우에는 최소한 30일 이상의 사전 유예기간을 두고 공지합니다. 이 경우 당 사이트는 개정 전
내용과 개정 후 내용을 명확하게 비교하여 이용자가 알기 쉽도록 표시합니다.
제 4 조(약관 외 준칙)
① 이 약관은 당 사이트가 제공하는 서비스에 관한 이용안내와 함께 적용됩니다.
② 이 약관에 명시되지 아니한 사항은 관계법령의 규정이 적용됩니다.
제 2 장 이용계약의 체결
제 5 조 (이용계약의 성립 등)
① 이용계약은 이용고객이 당 사이트가 정한 약관에 「동의합니다」를 선택하고, 당 사이트가 정한
온라인신청양식을 작성하여 서비스 이용을 신청한 후, 당 사이트가 이를 승낙함으로써 성립합니다.
② 제1항의 승낙은 당 사이트가 제공하는 과학기술정보검색, 맞춤정보, 서지정보 등 다른 서비스의 이용승낙을
포함합니다.
제 6 조 (회원가입)
서비스를 이용하고자 하는 고객은 당 사이트에서 정한 회원가입양식에 개인정보를 기재하여 가입을 하여야 합니다.
제 7 조 (개인정보의 보호 및 사용)
당 사이트는 관계법령이 정하는 바에 따라 회원 등록정보를 포함한 회원의 개인정보를 보호하기 위해 노력합니다. 회원 개인정보의 보호 및 사용에 대해서는 관련법령 및 당 사이트의 개인정보 보호정책이 적용됩니다.
제 8 조 (이용 신청의 승낙과 제한)
① 당 사이트는 제6조의 규정에 의한 이용신청고객에 대하여 서비스 이용을 승낙합니다.
② 당 사이트는 아래사항에 해당하는 경우에 대해서 승낙하지 아니 합니다.
- 이용계약 신청서의 내용을 허위로 기재한 경우
- 기타 규정한 제반사항을 위반하며 신청하는 경우
제 9 조 (회원 ID 부여 및 변경 등)
① 당 사이트는 이용고객에 대하여 약관에 정하는 바에 따라 자신이 선정한 회원 ID를 부여합니다.
② 회원 ID는 원칙적으로 변경이 불가하며 부득이한 사유로 인하여 변경 하고자 하는 경우에는 해당 ID를
해지하고 재가입해야 합니다.
③ 기타 회원 개인정보 관리 및 변경 등에 관한 사항은 서비스별 안내에 정하는 바에 의합니다.
제 3 장 계약 당사자의 의무
제 10 조 (KISTI의 의무)
① 당 사이트는 이용고객이 희망한 서비스 제공 개시일에 특별한 사정이 없는 한 서비스를 이용할 수 있도록
하여야 합니다.
② 당 사이트는 개인정보 보호를 위해 보안시스템을 구축하며 개인정보 보호정책을 공시하고 준수합니다.
③ 당 사이트는 회원으로부터 제기되는 의견이나 불만이 정당하다고 객관적으로 인정될 경우에는 적절한 절차를
거쳐 즉시 처리하여야 합니다. 다만, 즉시 처리가 곤란한 경우는 회원에게 그 사유와 처리일정을 통보하여야
합니다.
제 11 조 (회원의 의무)
① 이용자는 회원가입 신청 또는 회원정보 변경 시 실명으로 모든 사항을 사실에 근거하여 작성하여야 하며,
허위 또는 타인의 정보를 등록할 경우 일체의 권리를 주장할 수 없습니다.
② 당 사이트가 관계법령 및 개인정보 보호정책에 의거하여 그 책임을 지는 경우를 제외하고 회원에게 부여된
ID의 비밀번호 관리소홀, 부정사용에 의하여 발생하는 모든 결과에 대한 책임은 회원에게 있습니다.
③ 회원은 당 사이트 및 제 3자의 지적 재산권을 침해해서는 안 됩니다.
제 4 장 서비스의 이용
제 12 조 (서비스 이용 시간)
① 서비스 이용은 당 사이트의 업무상 또는 기술상 특별한 지장이 없는 한 연중무휴, 1일 24시간 운영을
원칙으로 합니다. 단, 당 사이트는 시스템 정기점검, 증설 및 교체를 위해 당 사이트가 정한 날이나 시간에
서비스를 일시 중단할 수 있으며, 예정되어 있는 작업으로 인한 서비스 일시중단은 당 사이트 홈페이지를
통해 사전에 공지합니다.
② 당 사이트는 서비스를 특정범위로 분할하여 각 범위별로 이용가능시간을 별도로 지정할 수 있습니다. 다만
이 경우 그 내용을 공지합니다.
제 13 조 (홈페이지 저작권)
① NDSL에서 제공하는 모든 저작물의 저작권은 원저작자에게 있으며, KISTI는 복제/배포/전송권을 확보하고
있습니다.
② NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 상업적 및 기타 영리목적으로 복제/배포/전송할 경우 사전에 KISTI의 허락을
받아야 합니다.
③ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 보도, 비평, 교육, 연구 등을 위하여 정당한 범위 안에서 공정한 관행에
합치되게 인용할 수 있습니다.
④ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 무단 복제, 전송, 배포 기타 저작권법에 위반되는 방법으로 이용할 경우
저작권법 제136조에 따라 5년 이하의 징역 또는 5천만 원 이하의 벌금에 처해질 수 있습니다.
제 14 조 (유료서비스)
① 당 사이트 및 협력기관이 정한 유료서비스(원문복사 등)는 별도로 정해진 바에 따르며, 변경사항은 시행 전에
당 사이트 홈페이지를 통하여 회원에게 공지합니다.
② 유료서비스를 이용하려는 회원은 정해진 요금체계에 따라 요금을 납부해야 합니다.
제 5 장 계약 해지 및 이용 제한
제 15 조 (계약 해지)
회원이 이용계약을 해지하고자 하는 때에는 [가입해지] 메뉴를 이용해 직접 해지해야 합니다.
제 16 조 (서비스 이용제한)
① 당 사이트는 회원이 서비스 이용내용에 있어서 본 약관 제 11조 내용을 위반하거나, 다음 각 호에 해당하는
경우 서비스 이용을 제한할 수 있습니다.
- 2년 이상 서비스를 이용한 적이 없는 경우
- 기타 정상적인 서비스 운영에 방해가 될 경우
② 상기 이용제한 규정에 따라 서비스를 이용하는 회원에게 서비스 이용에 대하여 별도 공지 없이 서비스 이용의
일시정지, 이용계약 해지 할 수 있습니다.
제 17 조 (전자우편주소 수집 금지)
회원은 전자우편주소 추출기 등을 이용하여 전자우편주소를 수집 또는 제3자에게 제공할 수 없습니다.
제 6 장 손해배상 및 기타사항
제 18 조 (손해배상)
당 사이트는 무료로 제공되는 서비스와 관련하여 회원에게 어떠한 손해가 발생하더라도 당 사이트가 고의 또는 과실로 인한 손해발생을 제외하고는 이에 대하여 책임을 부담하지 아니합니다.
제 19 조 (관할 법원)
서비스 이용으로 발생한 분쟁에 대해 소송이 제기되는 경우 민사 소송법상의 관할 법원에 제기합니다.
[부 칙]
1. (시행일) 이 약관은 2016년 9월 5일부터 적용되며, 종전 약관은 본 약관으로 대체되며, 개정된 약관의 적용일 이전 가입자도 개정된 약관의 적용을 받습니다.