• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제36권1호
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• pp.23-34
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• 2009

목 적: 중간엽 줄기세포를 임상에 적용하기 위해서는 체외 배양을 통한 세포증식 과정이 필요하나, 오랜 기간 동안 체외 배양을 하게 되면 노화되어 특성이 변하고 분화 능력 또한 감소하게 된다. 따라서 현재까지는 초기 계대배양의 세포만이 임상에 적용되고 있는 실정이며 체외에서의 세포 배양이 세포의 특성에 미치는 영향에 대한 연구와 함께 세포의 특성 변화 없이 체외증식이 가능하도록 하는 연구들이 골수 및 지방유래 중간엽 줄기세포에서 보고되고 있다. 그러나 현재 탯줄유래 줄기세포의 체외 배양에 따른 특성 변화 분석 연구는 아직 잘 이루어지지 않고 있다. 본 연구의 목적은 탯줄유래 줄기세포의 체외 배양 시 계대배양 증가에 따른 줄기세포의 특성 변화를 분석하고자 하였다. 연구방법: 사람의 탯줄유래 줄기세포 (human umbilical cord-derived stem cells, HUC)를 분리하여 in vitro에서 계대배양하였다. 계대배양에 따른 세포의 형태와 population doubling time (PDT)을 조사하고 RT-PCR 방법을 이용하여 mRNA 분석을 하였으며 면역세포화학 염색법을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다. 결 과: 탯줄유래 줄기세포는 평균 10번의 계대배양 후 senescence를 나타냈다. 세포의 형태는 7번째 계대배양 이후 세포질이 넓어지고 세포의 크기가 커지는 변화를 나타냈으며 PDT가 증가하기 시작하였다. 계대배양 4, 8, 10번째 시기의 세포의 mRNA 변화를 분석한 결과 Oct-4, HNF-4${\alpha}$, mRNA는 10번째 계대배양까지 지속적으로 발현하였으나 nestin, vimentin mRNA는 지속적으로 발현이 감소하였고 SCF mRNA는 지속적으로 발현이 감소하였다. 이에 반해 HLA-DR${\alpha}$, Pax-6, BMP-2 mRNA는 모든 계대배양 시기의 세포에서 발현되지 않았다. 면역세포화학 분석법을 통한 3, 6, 9번째 계대배양 세포의 단백질 발현 분석 결과 SSEA-3와 SSEA-4는 3, 6, 9번째 계대배양 세포 모두에서 발현하였으나 ICAM-1과 HLA-ABC는 계대배양이 증가함에 따라 발현이 증가되었다. Thy-1 단백질은 p9에서 발현이 증가되었으며 이와 반대로 TRA-1-60와 VCAM-1 단백질은 p6과 p9 시기에 발현이 감소되었다. HLA-DR 단백질은 모든 계대배양 시기에 발현되지 않았다. 결 론: 본 연구결과 탯줄유래 줄기세포는 체외 배양 시 줄기세포 특성이 일부 변하는 것을 관찰하였다. 앞으로 줄기세포의 특성을 유지할 수 있는 체외 배양법의 발달을 위한 연구들이 수행 되야 할 것으로 사료된다.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제30권3호
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• pp.439-445
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• 2017

Objective: Production of alpha-1,3-galactosyltransferase (${\alpha}GT$)-deficient pigs is essential to overcome xenograft rejection in pig-to-human xenotransplantation. However, the production of such pigs requires a great deal of cost, time, and labor. Heterozygous ${\alpha}GT$ knockout pigs should be bred at least for two generations to ultimately obtain homozygote progenies. The present study was conducted to produce ${\alpha}GT$-deficient miniature pigs in much reduced time using mitotic recombination in neonatal ear skin fibroblasts. Methods: Miniature pig fibroblasts were transfected with ${\alpha}GT$ gene-targeting vector. Resulting gene-targeted fibroblasts were used for nuclear transfer (NT) to produce heterozygous ${\alpha}GT$ gene-targeted piglets. Fibroblasts isolated from ear skin biopsies of these piglets were cultured for 6 to 8 passages to induce loss of heterozygosity (LOH) and treated with biotin-conjugated IB4 that binds to galactose-${\alpha}$-1,3-galactose, an epitope produced by ${\alpha}GT$. Using magnetic activated cell sorting, cells with monoallelic disruption of ${\alpha}GT$ were removed. Remaining cells with LOH carrying biallelic disruption of ${\alpha}GT$ were used for the second round NT to produce homozygous ${\alpha}GT$ gene-targeted piglets. Results: Monoallelic mutation of ${\alpha}GT$ gene was confirmed by polymerase chain reaction in fibroblasts. Using these cells as nuclear donors, three heterozygous ${\alpha}GT$ gene-targeted piglets were produced by NT. Fibroblasts were collected from ear skin biopsies of these piglets, and homozygosity was induced by LOH. The second round NT using these fibroblasts resulted in production of three homozygous ${\alpha}GT$ knockout piglets. Conclusion: The present study demonstrates that the time required for the production of ${\alpha}GT$-deficient miniature pigs could be reduced significantly by postnatal skin biopsies and subsequent selection of mitotic recombinants. Such procedure may be beneficial for the production of homozygote knockout animals, especially in species, such as pigs, that require a substantial length of time for breeding.