Monoclonal antibodies against glutamate dehydrogenase (GDH) from Sulfolobus solfataricus were produced and characterized using epitope mapping and biosensor technology, Five monoclonal antibodies raised against S. solfataricus GDH were each identified as a single protein band that comigrated with purified S. solfataricus GDH on the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblot. Epitope mapping analysis showed that only one subgroup among the antibodies tested recognized the same peptide fragments of GDH. Using the anti-S. solfataricus GDH antibodies as probes, the cross-reactivities of GDHs from various sources were investigated and it was found that the mammalian GDH is not immunologically related to S. solfataricus GDH. The structural differences between the microbial and mammalian GDHs were further investigated using biosensor technology (Pharmacia BIAcore) and monoclonal antibodies against S. solfataricus and bovine brain. The binding affinity of S. solfataricus glutamate dehydrogenase anti-S. solfataricus for GDH ($K_D$=11 nM) was much tighter than that of anti-bovine for GDH ($K_D$=450 nM). These results, together with the epitope mapping analysis, suggest that there may be structural differences between the two GDH species, in addition to their different biochemical properties.
A thermostable esterase from the hyper thermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus was partially purified 590-fold with $16.2\%$ recovery. The partially purified esterase had a specific activity of $29.5\;{\mu}mol\;min^{-1}mg^{-1}$ when the enzyme activity was determined using p-nitrophenyl butyrate as a substrate. The apparent molecular weight was about 100 kDa, while the optimum temperature and pH for esterase were $75^{\circ}C$ and 8.0, respectively. The enzyme showed high thermal stability and solvent tolerance in comparison to its mesophilic counterpart. The enzyme also showed chiral resolution activity for (S)-ibuprofen, indicating that S. solfataricus esterase can be used for the production of commercially important chiral drugs.
Two low-salt complex media, bactopeptone and desalted yeast extract, were used for high density cultivation of the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus (DSM 1617). Bactopeptone, which has low mineral ion content among various complex media, was good for cell growth in batch cultures; the maximal cell density in bactopeptone was comparable to that in yeast extract. However, cell growth was rather poor when bactopeptone was added by the fed-batch procedure. Since several vitamins are deficient in abctopeptone, the effect of vitamins on cell growth was examined. Among the vitamins tested, pyridoxine was found to improve the growth rate of S. solfataricus. To reduce the growth inhibition caused by mineral ions, yeast extract was dialyzed against distilled water and then fed-batch cultures were carried out using a fed medium containing desalted yeast extract. Although the concentrations of mineral ions in yeast extract were significantly lowered by the dialysis whether low molecular weight solutes in yest extract are crucial for cell growth, we investigated the effect of trehalose, a most abundant compatible solute in yeast extract, on the growth pattern. Cell densities were increased and the length of the lag phase was markedly shortened by the presence of trehalose, indicating that trehalose plays an important role in the growth of S. solfataricus.
Utilization of yeast extract and formation of byproduct metabolite were investigated for hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus (DSH 1617). In both batch and fed-batch cultivations of S. solfataricus, maximal cell density, {{{{ { NH}`_{4 } ^{ +} }}} ion production and pH change were highly dependent on the ratio of yeast extract to glucose in the medium. Variation of {{{{ { NH}`_{4 } ^{ +} }}}} ion level was identified as a major cause of pH change during cultivation, and acidification of culture broth was attributed to consumption of {{{{ { NH}`_{4 } ^{ +} }}}} ions rather than formation of acid byproducts. It was also observed that increase of {{{{ { NH}`_{4 } ^{ +} }}}} ion concentrations in the medium resulted in greater degree of growth inhibition.
Park, Young-Jun;Yoo, Chul-Bae;Choi, Soo-Young;Lee, Hee-Bong
BMB Reports
/
v.39
no.1
/
pp.46-54
/
2006
The coenzyme A-acylating 2-oxoacid:ferredoxin oxidoreductase and ferredoxin (an effective electron acceptor) were purified from the hyperthermophilic archaeon, Sulfolobus solfataricus P1 (DSM1616). The purified ferredoxin is a monomeric protein with an apparent molecular mass of approximately 11 kDa by SDS-PAGE and of $11,180{\pm}50$ Da by MALDI-TOF mass spectrometry. Ferredoxin was identified to be a dicluster, [3Fe-4S][4Fe-4S], type ferredoxin by spectrophotometric and EPR studies, and appeared to be zinc-containing based on the shared homology of its N-terminal sequence with those of known zinc-containing ferredoxins. On the other hand, the purified 2-oxoacid: ferredoxin oxidoreductase was found to be a heterodimeric enzyme consisting of 69 kDa $\alpha$ and 34 kDa $\beta$ subunits by SDS-PAGE and MALDI-TOF mass spectrometry. The purified enzyme showed a specific activity of 52.6 units/mg for the reduction of cytochrome c with 2-oxoglutarate as substrate at $55^{\circ}C$, pH 7.0. Maximum activity was observed at $70^{\circ}C$ and the optimum pH for enzymatic activity was 7.0 -8.0. The enzyme displays broad substrate specificity toward 2-oxoacids, such as pyruvate, 2-oxobutyrate, and 2-oxoglutarate. Among the 2-oxoacids tested (pyruvate, 2-oxobutyrate, and 2-oxoglutarate), 2-oxoglutarate was found to be the best substrate with $K_m$ and $k_{cat}$ values of $163\;{\mu}M$ and $452\;min^{-1}$, respectively. These results provide useful information for structural studies on these two proteins and for studies on the mechanism of electron transfer between the two.
Dihydroxy-acid dehydratase (DHAD, 2,3-dihydroxy-acid hydrolyase, EC 4.2.1.9) is one of the key enzymes involved in the biosynthetic pathway of the branched chain amino acid isoleucine and valine. Although the enzyme have been purified and characterized in various mesophiles including bacteria and eukarya, the biochemical properties of DHAD has bee not yet reported from hyperthermophilic archaea. In this study, we cloned, expressed, and purified a DHAD homologue from the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus solfataricus P2, which grows optimally at $80\;^{\circ}C$ and pH 3, in E. coli. Characterization of the recombinant S. solfataricus DHAD (rSso_DHAD) revealed that it is the dimeric protein with a subunit molecular weight of 64,000 Da in native structure. rDHAD showed the highest activity toward 2,3-dihydroxyisovaleric acid among 17 aldonic acid substrates Interestingly, this enzyme also displayed 50 % activities toward some pentonic acids and hexonic acids when compared with the activity of this enzyme to the natural substrate. Moreover, rSso_DHAD indicated relatively higher activity toward D-gluconate than any other hexonic acids tested in substrates. $K_m$ and $V_{max}$ values of rSso_DHAD were calculated as $0.54\;{\pm}\;0.04\;mM$ toward 2,3dihydroxyisovalerate and $2.42\;{\pm}\;0.19\;mM$ toward D-gluconate, and as $21.6\;{\pm}\;0.4\;U/mg$ toward 2,3-dihydroxyisovalerate and $13.8\;{\pm}\;0.4\;U/mg$ toward D-gluconate, respectively. In the study for biochemical properties, the enzyme shows maximal activity between $70^{\circ}C$ and $80^{\circ}C$, and the pH range of pH 7.5 to 8.5. The half life time at $80^{\circ}C$ was 30 min. A divalent metal ion, $Mn^{2+}$, was only powerful activators, whereas other metal ions made the enzyme activity reduced. $Hg^{2+}$, organic mercury, and EDTA also strongly inhibited enzyme activities. Particularly, the rSso_DHAD activity was very stable under aerobic condition although the counterparts reported from mesophiles had been deactivated by oxygen.
Thermoplasma acidophilum is a thermoacidophilic archaeon that grows optimally at $59^{\circ}C$ and pH 2. Along with another thermoacidophilic archaeon, Sulfolobus solfataricus, it is known to metabolize glucose by the non-phosphorylated Entner-Doudoroff (nED) pathway. In the course of these studies, the specific activities of glyceraldehyde dehydrogenase and glycerate kinase, two enzymes that are involved in the downstream part of the nED pathway, were found to be much higher in T. acidophilum than in S. solfataricus. To characterize glycerate kinase, the enzyme was purified to homogeneity from T. acidophilum cell extracts. The N-terminal sequence of the purified enzyme was in exact agreement with that of Ta0453m in the genome database, with the removal of the initiator methionine. Furthermore, the enzyme was a monomer with a molecular weight of 49kDa and followed Michaelis-Menten kinetics with $K_m$ values of 0.56 and 0.32mM for DL-glycerate and ATP, respectively. The enzyme also exhibited excellent thermal stability at $70^{\circ}C$. Of the seven sugars and four phosphate donors tested, only DL-glycerate and ATP were utilized by glycerate kinase as substrates. In addition, a coupled enzyme assay indicated that 2-phosphoglycerate was produced as a product. When divalent metal ions, such as $Mn^{2+},\;CO^{2+},\;Ni^{2+},\;Zn^{2+},\;Ca^{2+},\;and\;Sr^{2+}$, were substituted for $Mg^{2+}$ the enzyme activities were less than 10% of that obtained in the presence of $Mg^{2+}$. The amino acid sequence of T. acidophilum glycerate kinase showed no similarity with E. coli glycerate kinases, which belong to the first glycerate kinase family. This is the first report on the biochemical characterization of an enzyme which belongs to a member of the second glycerate kinase family.
A Sulfolobus-E. coli shuttle vector for an efficient expression of the target gene in S. acidocaldarius strain was constructed. The plasmid-based vector pSM21 and its derivative pSM21N were generated based on the pUC18 and Sulfolobus cryptic plasmid pRN1. They carried the S. solfataricus P2 pyrEF gene for the selection marker, a multiple cloning site (MCS) with C-terminal histidine tag, and a constitutive promoter of the S. acidocaldarius gdhA gene for strong expression of the target gene, as well as the pBR322 origin and ampicillin-resistant gene for E. coli propagation. The advantage of pSM21 over other Sulfolobus shuttle vectors is that it contains a MCS and a histidine tag for the simple and easy cloning of a target gene as well as one-step purification by histidine affinity chromatography. For successful expression of the foreign genes, two genes from archaeal origins (PH0193 and Ta0298) were cloned into pSM21N and the functional expression was examined by enzyme activity assay. The recombinant PH0193 was successfully expressed under the control of the gdhA promoter and purified from the cultures by His-tag affinity chromatography. The yield was approximately 1 mg of protein per liter of cultures. The enzyme activity measurements of PH0913 and Ta0298 revealed that both proteins were expressed as an active form in S. acidocaldarius. These results indicate that the pSM21N shuttle vector can be used for the functional expression of foreign archaeal genes that form insoluble aggregates in the E. coli system.
With the purpose of facilitating the process of stable strain generation, a shuttle vector for integration of genes via a double recombination event into two ectopic sites on the Sulfolobus acidocaldarius chromosome was constructed. The novel chromosomal integration and expression vector pINEX contains a pyrE gene from S. solfataricus P2 ($pyrE_{sso}$) as an auxotrophic selection marker, a multiple cloning site with histidine tag, the internal sequences of malE and malG for homologous recombination, and the entire region of pGEM-T vector, except for the multiple cloning region, for propagation in E. coli. For stable expression of the target gene, an ${\alpha}$-glucosidase-producing strain of S. acidocaldarius was generated employing this vector. The malA gene (saci_1160) encoding an ${\alpha}$-glucosidase from S. acidocaldarius fused with the glutamate dehydrogenase ($gdhA_{saci}$) promoter and leader sequence was ligated to pINEX to generate pINEX_malA. Using the "pop-in" and "pop-out" method, the malA gene was inserted into the genome of MR31 and correct insertion was verified by colony PCR and sequencing. This strain was grown in YT medium without uracil and purified by His-tag affinity chromatography. The ${\alpha}$-glucosidase activity was confirmed by the hydrolysis of $pNP{\alpha}G$. The pINEX vector should be applicable in delineating gene functions in this organism.
To study the functional genomic analysis of a crenachaeon Sulfolobus acidocaldarius, we have constructed an auxotrophic mutant based on pyrEF, which encodes the pyrimidine biosynthetic enzymes orotate phosphoribosyltransferase and orotidine-5'-monophosphate decarboxylase. S. acidocaldarius was shown to be sensitive to 5-fluoroorotic acid (5-FOA), which can be selected for mutations in pyrEF genes within a pyrimidine biosynthesis cluster. Spontaneous 5-FOA-resistant mutants by ultraviolet, KH1U and KH2U, were found to contain two point mutations and a frame shift mutation in pyrE, respectively. Mutations at these sites from KH1U and KH2U decreased the activity of orotate phosphoribosyltransferase encoded by the pyrE gene and blocked the degradation of 5-FOA into toxic 5-FOMP and 5-FUMP that kill the cells. Therefore, KH1U and KH2U were uracil auxotrophs. Transformation of Sulfolobus-Escherichia coli shuttle vector pC bearing pyrEF genes from S. solfataricus P2 into S. acidocaldarius mutant KH2U restored 5-FOA sensitivity and overcame the uracil auxotrophy. This study establishes an efficient genetic strategy towards the systematic knockout of genes in S. acidocaldarius.
본 웹사이트에 게시된 이메일 주소가 전자우편 수집 프로그램이나
그 밖의 기술적 장치를 이용하여 무단으로 수집되는 것을 거부하며,
이를 위반시 정보통신망법에 의해 형사 처벌됨을 유념하시기 바랍니다.
[게시일 2004년 10월 1일]
이용약관
제 1 장 총칙
제 1 조 (목적)
이 이용약관은 KoreaScience 홈페이지(이하 “당 사이트”)에서 제공하는 인터넷 서비스(이하 '서비스')의 가입조건 및 이용에 관한 제반 사항과 기타 필요한 사항을 구체적으로 규정함을 목적으로 합니다.
제 2 조 (용어의 정의)
① "이용자"라 함은 당 사이트에 접속하여 이 약관에 따라 당 사이트가 제공하는 서비스를 받는 회원 및 비회원을
말합니다.
② "회원"이라 함은 서비스를 이용하기 위하여 당 사이트에 개인정보를 제공하여 아이디(ID)와 비밀번호를 부여
받은 자를 말합니다.
③ "회원 아이디(ID)"라 함은 회원의 식별 및 서비스 이용을 위하여 자신이 선정한 문자 및 숫자의 조합을
말합니다.
④ "비밀번호(패스워드)"라 함은 회원이 자신의 비밀보호를 위하여 선정한 문자 및 숫자의 조합을 말합니다.
제 3 조 (이용약관의 효력 및 변경)
① 이 약관은 당 사이트에 게시하거나 기타의 방법으로 회원에게 공지함으로써 효력이 발생합니다.
② 당 사이트는 이 약관을 개정할 경우에 적용일자 및 개정사유를 명시하여 현행 약관과 함께 당 사이트의
초기화면에 그 적용일자 7일 이전부터 적용일자 전일까지 공지합니다. 다만, 회원에게 불리하게 약관내용을
변경하는 경우에는 최소한 30일 이상의 사전 유예기간을 두고 공지합니다. 이 경우 당 사이트는 개정 전
내용과 개정 후 내용을 명확하게 비교하여 이용자가 알기 쉽도록 표시합니다.
제 4 조(약관 외 준칙)
① 이 약관은 당 사이트가 제공하는 서비스에 관한 이용안내와 함께 적용됩니다.
② 이 약관에 명시되지 아니한 사항은 관계법령의 규정이 적용됩니다.
제 2 장 이용계약의 체결
제 5 조 (이용계약의 성립 등)
① 이용계약은 이용고객이 당 사이트가 정한 약관에 「동의합니다」를 선택하고, 당 사이트가 정한
온라인신청양식을 작성하여 서비스 이용을 신청한 후, 당 사이트가 이를 승낙함으로써 성립합니다.
② 제1항의 승낙은 당 사이트가 제공하는 과학기술정보검색, 맞춤정보, 서지정보 등 다른 서비스의 이용승낙을
포함합니다.
제 6 조 (회원가입)
서비스를 이용하고자 하는 고객은 당 사이트에서 정한 회원가입양식에 개인정보를 기재하여 가입을 하여야 합니다.
제 7 조 (개인정보의 보호 및 사용)
당 사이트는 관계법령이 정하는 바에 따라 회원 등록정보를 포함한 회원의 개인정보를 보호하기 위해 노력합니다. 회원 개인정보의 보호 및 사용에 대해서는 관련법령 및 당 사이트의 개인정보 보호정책이 적용됩니다.
제 8 조 (이용 신청의 승낙과 제한)
① 당 사이트는 제6조의 규정에 의한 이용신청고객에 대하여 서비스 이용을 승낙합니다.
② 당 사이트는 아래사항에 해당하는 경우에 대해서 승낙하지 아니 합니다.
- 이용계약 신청서의 내용을 허위로 기재한 경우
- 기타 규정한 제반사항을 위반하며 신청하는 경우
제 9 조 (회원 ID 부여 및 변경 등)
① 당 사이트는 이용고객에 대하여 약관에 정하는 바에 따라 자신이 선정한 회원 ID를 부여합니다.
② 회원 ID는 원칙적으로 변경이 불가하며 부득이한 사유로 인하여 변경 하고자 하는 경우에는 해당 ID를
해지하고 재가입해야 합니다.
③ 기타 회원 개인정보 관리 및 변경 등에 관한 사항은 서비스별 안내에 정하는 바에 의합니다.
제 3 장 계약 당사자의 의무
제 10 조 (KISTI의 의무)
① 당 사이트는 이용고객이 희망한 서비스 제공 개시일에 특별한 사정이 없는 한 서비스를 이용할 수 있도록
하여야 합니다.
② 당 사이트는 개인정보 보호를 위해 보안시스템을 구축하며 개인정보 보호정책을 공시하고 준수합니다.
③ 당 사이트는 회원으로부터 제기되는 의견이나 불만이 정당하다고 객관적으로 인정될 경우에는 적절한 절차를
거쳐 즉시 처리하여야 합니다. 다만, 즉시 처리가 곤란한 경우는 회원에게 그 사유와 처리일정을 통보하여야
합니다.
제 11 조 (회원의 의무)
① 이용자는 회원가입 신청 또는 회원정보 변경 시 실명으로 모든 사항을 사실에 근거하여 작성하여야 하며,
허위 또는 타인의 정보를 등록할 경우 일체의 권리를 주장할 수 없습니다.
② 당 사이트가 관계법령 및 개인정보 보호정책에 의거하여 그 책임을 지는 경우를 제외하고 회원에게 부여된
ID의 비밀번호 관리소홀, 부정사용에 의하여 발생하는 모든 결과에 대한 책임은 회원에게 있습니다.
③ 회원은 당 사이트 및 제 3자의 지적 재산권을 침해해서는 안 됩니다.
제 4 장 서비스의 이용
제 12 조 (서비스 이용 시간)
① 서비스 이용은 당 사이트의 업무상 또는 기술상 특별한 지장이 없는 한 연중무휴, 1일 24시간 운영을
원칙으로 합니다. 단, 당 사이트는 시스템 정기점검, 증설 및 교체를 위해 당 사이트가 정한 날이나 시간에
서비스를 일시 중단할 수 있으며, 예정되어 있는 작업으로 인한 서비스 일시중단은 당 사이트 홈페이지를
통해 사전에 공지합니다.
② 당 사이트는 서비스를 특정범위로 분할하여 각 범위별로 이용가능시간을 별도로 지정할 수 있습니다. 다만
이 경우 그 내용을 공지합니다.
제 13 조 (홈페이지 저작권)
① NDSL에서 제공하는 모든 저작물의 저작권은 원저작자에게 있으며, KISTI는 복제/배포/전송권을 확보하고
있습니다.
② NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 상업적 및 기타 영리목적으로 복제/배포/전송할 경우 사전에 KISTI의 허락을
받아야 합니다.
③ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 보도, 비평, 교육, 연구 등을 위하여 정당한 범위 안에서 공정한 관행에
합치되게 인용할 수 있습니다.
④ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 무단 복제, 전송, 배포 기타 저작권법에 위반되는 방법으로 이용할 경우
저작권법 제136조에 따라 5년 이하의 징역 또는 5천만 원 이하의 벌금에 처해질 수 있습니다.
제 14 조 (유료서비스)
① 당 사이트 및 협력기관이 정한 유료서비스(원문복사 등)는 별도로 정해진 바에 따르며, 변경사항은 시행 전에
당 사이트 홈페이지를 통하여 회원에게 공지합니다.
② 유료서비스를 이용하려는 회원은 정해진 요금체계에 따라 요금을 납부해야 합니다.
제 5 장 계약 해지 및 이용 제한
제 15 조 (계약 해지)
회원이 이용계약을 해지하고자 하는 때에는 [가입해지] 메뉴를 이용해 직접 해지해야 합니다.
제 16 조 (서비스 이용제한)
① 당 사이트는 회원이 서비스 이용내용에 있어서 본 약관 제 11조 내용을 위반하거나, 다음 각 호에 해당하는
경우 서비스 이용을 제한할 수 있습니다.
- 2년 이상 서비스를 이용한 적이 없는 경우
- 기타 정상적인 서비스 운영에 방해가 될 경우
② 상기 이용제한 규정에 따라 서비스를 이용하는 회원에게 서비스 이용에 대하여 별도 공지 없이 서비스 이용의
일시정지, 이용계약 해지 할 수 있습니다.
제 17 조 (전자우편주소 수집 금지)
회원은 전자우편주소 추출기 등을 이용하여 전자우편주소를 수집 또는 제3자에게 제공할 수 없습니다.
제 6 장 손해배상 및 기타사항
제 18 조 (손해배상)
당 사이트는 무료로 제공되는 서비스와 관련하여 회원에게 어떠한 손해가 발생하더라도 당 사이트가 고의 또는 과실로 인한 손해발생을 제외하고는 이에 대하여 책임을 부담하지 아니합니다.
제 19 조 (관할 법원)
서비스 이용으로 발생한 분쟁에 대해 소송이 제기되는 경우 민사 소송법상의 관할 법원에 제기합니다.
[부 칙]
1. (시행일) 이 약관은 2016년 9월 5일부터 적용되며, 종전 약관은 본 약관으로 대체되며, 개정된 약관의 적용일 이전 가입자도 개정된 약관의 적용을 받습니다.