• The Plant Pathology Journal
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• 제26권1호
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• pp.25-31
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• 2010

Papaya ringspot virus (PRSV) causes the most widespread and devastating disease in papaya. Isolates of PRSV originating from different geographical regions in south India were collected and maintained on natural host papaya. The entire coat protein (CP) gene of Papaya ringspot virus-P biotype (PRSV-P) was amplified by RTPCR. The amplicon was inserted into pGEM-T vector, sequenced and sub cloned into a bacterial expression vector pRSET-A using a directional cloning strategy. The PRSV coat protein was over-expressed as a fusion protein in Escherichia coli. SDS-PAGE gel revealed that CP expressed as a ~40 kDa protein. The recombinant coat protein (rCP) fused with 6x His-tag was purified from E.coli using Ni-NTA resin. The antigenicity of the fusion protein was determined by western blot analysis using antibodies raised against purified PRSV. The purified rCP was used as an antigen to produce high titer PRSV specific polyclonal antiserum. The resulting antiserum was used to develop an immunocapture reverse transcription-polymerase chain reaction (IC-RT-PCR) assay and compared its sensitivity levels with ELISA based assays for detection of PRSV isolates. IC-RT-PCR was shown to be the most sensitive test followed by dot-blot immunobinding assay (DBIA) and plate trapped ELISA.

• Plant Resources
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• 제2권2호
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• pp.69-74
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• 1999

A rapid and sensitive assay for specific detection and identification of barley yellow mosaic virus(BaYMV) was set up using the reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR). A couple of primers was select to discriminate the viruses. PCR fragments of BaYMV(ca.0.9 kb) were obtained by using the method designed for BaYMV capsid protein. RT-PCR fragments were cloned with vector pT7 Blue and the resulting clones were sequenced. Capsid protein of BaYMV consisted of 297 amino acids and 891 nucleotides. The capsid protein sequence of BaYMV showed that 98% of nucleotides and 99% of amino acids homology.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제15권3호
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• pp.595-602
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• 2005

A one-step real-time quantitative RT-PCR assay in combination with automated RNA extraction was evaluated for routine testing of HCV RNA in the laboratory. Specific primers and probes were developed to detect 302 bp on 5'-UTR of HCV RNA. The assay was able to quantitate a dynamic linear range of $10^7-10^1$ HCV RNA copies/reaction ($R^2=0.997$). The synthetic HCV RNA standard of $1.84{\pm}0.1\;(mean{\pm}SD)$ copies developed in this study corresponded to 1 international unit (IU) of WHO International Standard for HCV RNA (96/790 I). The detection limit of the assay was 3 RNA copies/reaction (81 IU/ml) in plasma samples. The assay was comparable to the Amplicor HCV Monitor (Monitor) assay with correlation coefficient r=0.985, but was more sensitive than the Monitor assay. The assay could be completed within 3 h from RNA extraction to detection and data analysis for up to 32 samples. It allowed rapid RNA extraction, detection, and quantitation of HCV RNA in plasma samples. The method provided sufficient sensitivity and reproducibility and proved to be fast and labor-saving, so that it was suitable for high throughput HCV RNA test.

• 생명과학회지
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• 제29권6호
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• pp.653-661
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• 2019

본 연구는 siRNA 기반 치료제등의 핵산치료제 개발에 있어서 필수적인 약물의 생체내 흡수, 분포, 대사, 배설에 대한 동태의 확인을 위해 stem-loop RT-qPCR 법을 이용하여 보다 더 정확한 시험법을 확립하고자 하였다. siRNA에 특이적인 primer와 probe를 선별하여 siRNA 정량검출 시험법을 최적화하였다. siRNA 표준시료를 이용하여 최적화된 시험법을 적용하였을 때 siRNA 표준시료에 대한 Cp 값(y)간의 선형분석 결과, 기울기 평균 -3.3, 결정계수 $R^2$>0.99으로 확인되어 siRNA 표준시료와 Cp 값 간의 회귀성이 매우 높아 정량 분석이 가능한 시험법임을 확인하였고, 같은 표준시료를 이용한 stem-loop RT-qPCR의 검출한계(LOD)는 10 fM, 최소정량한계(LLOQ)는 100 fM이었다. 확립된 시험법의 신뢰성을 확인하기 위해 시험자를 다르게 하고, 시험법을 3회 반복하여 각각 진행한 결과, siRNA 표준시료에 대한 Cp 값(y)간의 선형분석 결과 기울기와 결정계수 $R^2$의 재현성(slope ${\pm}-3.2$, 결정계수 $R^2$>0.99)을 확인하였고, 표준 곡선으로부터 환산된 siRNA 표준시료의 회수율(recovery ${\pm}20%$)과 완건성이 우수함을 확인하였다. 확립된 stem-loop RT-qPCR을 생체내 존재하는 약물 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 시험동물에 siRNA를 주입 후 시간별 혈액을 채취하여 확립된 시험법으로 시험을 진행하였고 약물 동태학적 분석을 통해 siRNA치료제의 혈액내의 안정성을 확인하였다. 따라서 본연구에서 개발된 stem-loop RT-qPCR 분석법은 정확성, 정밀성 및 민감도가 높은 분석법으로 핵산치료제 개발 연구의 다양한 생체시료 분석 연구에 적용할 수 있을 것으로 기대한다.

• 대한의생명과학회지
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• 제19권2호
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• pp.90-97
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• 2013

The tuberculin skin test (TST) and interferon gamma (IFN-${\gamma}$) release assay (IGRA) have been widely used for diagnosis of latent tuberculosis infection (LTBI). In order to overcome limitations of current LTBI diagnostic methods, the development of a novel molecular assay which is able to measure the IFN-${\gamma}$ messenger RNA (mRNA) expression level after stimulation with Mycobacterium tuberculosis (MTB) specific antigen was recently developed. The ability of a molecular assay to detect MTB infection was similar to commercial IGRA however, the optimal incubation time for stimulating IFN-${\gamma}$ was not yet established. Therefore, in this study the direct comparisons of MTB Ag stimulation times (4 and 24 hrs) were performed for diagnosis of MTB infection. Data showed that the coincident rate between QFT-GIT IFN-${\gamma}$ ELISA and IFN-${\gamma}$ RT-PCR (4 hrs) was 88.35% and that of QFT-GIT and IFN-${\gamma}$ RT-PCR (24 hrs) was 70.85%. Based on a receiver operating characteristic (ROC) curve, the 4 hrs-MTB specific Ag stimulation time for IFN-${\gamma}$ RT-PCR had the significant P value, 95% CI value, and AUC (P < 0.0001, 95% CI=0.82 to 1.02, and AUC=0.9214) in comparison with 24 hrs-MTB specific Ag stimulation time (P = 0.009, 95% CI=0.06 to 0.94, and AUC=0.7711). These results show that 4-hr was the most optimal MTB Ag stimulation time for performing IFN-${\gamma}$ RT-PCR. Although semi-quantitative RT-PCR had a few analytical limitations, it might be useful as an alternative molecular diagnostic method for detecting MTB infection.

• Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
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• 제17권2호
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• pp.677-684
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• 2016

Background: Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a heterogeneous disease which requires a risk-stratified approach for appropriate treatment. Specific chromosomal translocations within leukemic blasts are important prognostic factors that allow identification of relevant subgroups. In this study, we developed a multiplex RT-PCR assay for detection of the 4 most frequent translocations in ALL (BCR-ABL, TEL-AML1, MLL-AF4, and E2A-PBX1). Materials and Methods: A total of 214 diagnosed ALL samples from both adult and pediatric ALL and 14 cases of CML patients (154 bone marrow and 74 peripheral blood samples) were assessed for specific chromosomal translocations by cytogenetic and multiplex RT-PCR assays. Results: The results showed that 46 cases of ALL and CML (20.2%) contained the fusion transcripts. Within the positive ALL patients, the most prevalent cryptic translocation observed was mBCR-ABL (p190) at 8.41%. In addition, other genetic rearrangements detected by the multiplex PCR were 4.21% TEL-AML1 and 2.34% E2A-PBX1, whereas MLL-AF4 exhibited negative results in all tested samples. Moreover, MBCR-ABL was detected in all 14 CML samples. In 16 samples of normal karyotype ALL (n=9), ALL with no cytogentic result (n=4) and CML with no Philadelphia chromosome (n=3), fusion transcripts were detected. Conclusions: Multiplex RT-PCR provides a rapid, simple and highly sensitive method to detect fusion transcripts for prognostic and risk stratification of ALL and CML patients.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제43권3호
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• pp.267-274
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• 2015

세포주를 이용하여 생산하는 생물의약품과 생산용 세포주는 세포 배양 과정 중에 사용되는 돼지 유래 trypsin으로 부터 외래성 돼지 유래 바이러스가 오염될 가능성이 있다. PTGV는 세포배양 유래 생물의악품 제조공정에서 오염될 수 있는 외래성 바이러스 중의 하나이다. 본 연구에서는 생물의 약품 제조공정에서 PTGV 안전성을 확보하기 위해, 세포주, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 PTGV를 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 PTGV 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 TaqMan probe real-time RT-PCR 시험법을 확립하였다. PTGV에 특이적인 primer와 probe를 선별하여 PTGV 정량검출 시험법을 최적화하였다. 세포배양법에 의한 감염역가와 비교한 결과 real-time RT-PCR의 검출한계는 1.10 × 10⁰ TCID₅₀/ml이었다. 확립된 시험법의 신뢰성을 보증하기 위해 시험법 검증을 실시한 결과 특이성과 재현성, 완건성이 우수함을 확인하였다. 확립된 real-time RT-PCR 을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 PTGV를 오염시킨 CHO-K1 세포주에서 PTGV 검출 시험을 실시하였다. PTGV를 감염시킨 CHO-K1 세포에서 세포변병효과를 관찰할 수 없었지만, 세포배양액에서 PTGV를 정량적으로 검출할 수 있었다.

• 한국식품과학회지
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• 제37권6호
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• pp.1018-1023
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• 2005

굴로부터 오염된 바이러스를 농축하고 검출하는 방법이 개발되었다. 바이러스를 인위적으로 굴 추출물에 접종시킨 후 polyethylene glycol(PEG)로 침전시키고 chloroform 또는 Freon으로 추출한 후 다시 PEG로 침전시켜 바이러스를 농축하였다. 각 단계별로 회수되는 폴리오바이러스의 량을 plaque assay를 이용하여 측정한 결과 처음 접종한 바이러스의 16.4-26.0%가 회수됨을 알 수 있었다. 검출을 위해서는 농축된 바이러스를 TRlzol로 추출한 후 바이러스의 RNA를 희석하거나 silica gel membrane을 이용하여 capture한 후 RT-PCR로 확인할 수 있었다. 그러나 상추와 햄버거에서 RT-PCR 방해물질을 효과적으로 제거하는 $QIAshredder^{TM}$ Homogenizer는 굴에 존재하는 방해물질을 제거하지 못하였다. 식품에 오염된 바이러스 농축을 위해 Freon이 일반적으로 사용되나 chloroform으로 대체가 가능하였다. 검출한계에 있어 굴 전체의 추출물을 사용하는 것과 소화기만을 분리하여 사용하는 경우 차이가 없으므로 RT-PCR 방해물질이 굴 전체조직에 고루 분산되어 있다고 판단된다. nested PCR은 이 방법의 효율을 높여주었다. 전체적으로 이 방법을 사용하면 굴로부터 오염된 노로바이러스의 검출이 가능하다고 판단된다.

• 생명과학회지
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• 제31권12호
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• pp.1100-1109
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• 2021

염생식물인 비쑥은 식용이 가능한 약용식물로서 살충, 항염, 항콜레스테롤, 해열, 항균 활성 등이 알려져 있다. 본 연구에서는 phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA)로 자극된 인간 섬유육종 HT-1080 세포에서 5가지 활성검색방법 즉 : gelatin zymography, MMPs ELISA, wound healing assay, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), Western blot을 이용하여 비쑥의 조추출물과 그 용매 분획물의 MMP-2와 MMP-9 효소 활성에 대한 저해 효과를 평가하였다. 비쑥 시료들을 메틸렌 클로라이드(MC)와 메탄올(MeOH)로 각각 2번 추출하여 합한 것을 조추출물로 사용하였으며 이 조추출물은 MMP-2와 MMP-9 효소활성에 대해 유의한 억제 효과를 나타내었다. 이 조추출물은 용매극성에 따라 다시 n-hexane, 85% aq.MeOH, n-butanol 및 물 분획층으로 분획되었으며 이렇게 얻어진 4개의 용매 분획물들중에 n-hexane과 85% aq.MeOH 분획이 gelatin zymography와 MMP ELISA assay에서 MMP-2와 MMP-9의 활성을 효과적으로 억제하였다. 또한 wound healing assay, RT-PCR 및 Western blot assay에서 H₂O 분획을 제외한 모든 용매 분획물들이 세포 이동, 그리고 MMP-2 및 MMP-9의 mRNA와 단백질 발현을 유의하게 억제하였다.

• KSBB Journal
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• 제23권4호
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• pp.303-310
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• 2008

소의 혈액, 세포, 조직, 기관 등 소유래 물질을 원료로 사용한 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제의 경우 소유래 원료물질에 다양한 바이러스가 오염된 사례가 있기 때문에 바이러스 안전성 검증이 필수적이다. BPIV3는 동물 세포주, 우혈청 등에 가장 흔하게 오염되는 바이러스이다. 소유래 물질을 원료로 하는 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제 등에서 BPIV3 안전성을 확보하기 위해, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 BPIV3를 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 BPIV3 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 BPIV3 real-time RT-PCR 시험법을 확립하였다. BPIV3에 특이적인 primer를 선별하였으며, 형광염료 SYBR Green I을 사용하여 BPIV3 RNA 정량 검출 시험법을 최적화하였다. 세포배양법에 의한 감염역가와 비교한 결과 real-time RT-PCR 민감도는 2.8 $TCID_{50}/mL$이었다. 확립된 시험법의 신뢰성 (reliability)을 보증하기 위해 시험법 검증을 실시한 결과 특이성 (specificity)과 재현성 (reproducibility)이 우수함을 확인하였다. 확립된 real-time RT-PCR을 생물의 약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPIV3를 오염시킨 CHO 세포주와 소유래 콜라겐에서 BPIV3 검출 시험을 실시하였다. BPIV3를 감염시킨 CHO 세포와 세포배양 상청액에서 BPIV3를 정량적으로 검출할 수 있었다. 소유래 콜라겐에서도 7.8 $TCID_{50}/mL$ 까지 정량적으로 검출할 수 있었다. 위와 같은 결과에서 확립된 BPIV3 real-time RT-PCR 시험법은 생물의약품 안전성 보증을 위한 세포주 검증, 생물의약품 생산 공정 검증, 바이러스 제거 공정 검증 등에서 감염역가 시험법과 같은 생물학적 시험법을 대신할 수 있는 신속하고, 특이성과 민감성이 우수한 시험법임을 확인하였다.