• The Plant Pathology Journal
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• 제35권1호
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• pp.41-50
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• 2019

Sugarcane bacilliform viruses (SCBV), which belong to the genus Badnavirus, family Caulimoviridae, are an important DNA virus complex that infects sugarcane. To explore the genetic diversity of the sugarcane-infecting badnavirus complex in China, we tested 392 sugarcane leaf samples collected from Fujian, Yunnan, and Hainan provinces for the occurrence of SCBV by polymerase chain reaction (PCR) assays using published primers SCBV-F and SCBV-R that target the reverse transcriptase/ribonuclease H (RT/RNase H) regions of the viral genome. A total of 111 PCR-amplified fragments (726 bp) from 63 SCBV-positive samples were cloned and sequenced. A neighbor-joining phylogenetic tree was constructed based on the SCBV sequences from this study and 34 published sequences representing 18 different phylogroups or genotypes (SCBV-A to -R). All SCBV-tested isolates could be classified into 20 SCBV phylogenetic groups from SCBV-A to -T. Of nine SCBV phylogroups reported in this study, two novel phylogroups, SCBV-S and SCBV-T, that share 90.0-93.2% sequence identity and show 0.07-0.11 genetic distance with each other in the RT/RNase H region, are proposed. SCBV-S had 57.6-92.2% sequence identity and 0.09-0.66 genetic distance, while SCBV-T had 58.4-90.0% sequence identity and 0.11-0.63 genetic distance compared with the published SCBV phylogroups. Additionally, two other Badnavirus species, Sugarcane bacilliform MO virus (SCBMOV) and Sugarcane bacilliform IM virus (SCBIMV), which originally clustered in phylogenetic groups SCBV-E and SCBV-F, respectively, are first reported in China. Our findings will help to understand the level of genetic heterogeneity present in the complex of Badnavirus species that infect sugarcane.

• 한국식물병리학회지
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• 제10권3호
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• pp.228-234
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• 1994

Genomic RNA was extracted from Cy strain of odontoglossum ringspot tobamovirus (ORSV-Cy) isolated from infected leaves of tobacco cv. Samsun. Size of the genomic RNA was about 6.6 kb in length. The genomic RNA was fractionated using Sephadex G-50 column chromatography into 2 fractions. They were polyadenylated at their 3'-end using E. coli poly(A) polymerase. Polyadenylated viral RNA was recovered by oligo (dT) primer adapter containing NotI restriction site and Moloney murine leukemia virus SuperScript reverse transcriptase (RNase H-). Second-strand cDNA was synthesized by using E. coli DNA ligase, E. coli DNA polymerase I and E. coli RNase H. Recombinant plasmids containing cDNAs for ORSV-Cy RNA ranged from about 800 bp to 3,000 bp. Among the selected 238 recombinants, pORCY-124 clone was the largest one covering 3'-terminal half of the viral RNA. This clone contained two restriction sites for EcoRI and XbaI and one site for AccI, AvaI, BglII, BstXI, HindIII, PstI, and TthIII 1. respectively. The clone contained partial viral replicase, a full-length movement protein and a complete coat protein genes followed by a 3' untranslated region of 414 nucleotides based on restriction mapping and nucleotide sequencing analyses. Clones pORCY-028, -068, -072, -187 and -224 were overlapped with the pORCY-124. Clones pORCY-014 and -095 covered 5' half upstream from the middle region of the viral RNA, which was estimated based on restriction mapping and partial sequence analysis. Constructed cDNA library covered more than 90% of the viral genome.

• 한국자원식물학회지
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• 제14권1호
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• pp.65-70
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• 2001

본 연구는 random primer를 이용하여 PCR을 수행하기 위한 딸기 DNA증폭의 최적조건을 구명하여 조직배양된 딸기 배양묘와 모본과의 유전적인 동일성의 여부 및 품종을 판별할 수 있는 marker를 개발하기 위하여 수행하였다. 추출한 딸기 커(\ulcorner)잣 DNA를 proteinase-K나 RNase-H를 처리하였을때 깨끗하고 순수한 DNA band를 확인할 수 있었으며, 50ng의 template DNA, 10pmol의 primer, 37oC annealing 온도로 45 cycle로서 PCR을 행하는 것이 가장 효율적이었다. 상기 실험결과로서 PCR적정조건을 확립한 후, UBC primer를 대상으로 딸기 여봉 DNA에서 PCR를 수행하여 RAPD의 양상을 조사한 결과 총 90개의 primer 중에서 딸기 genomic DNA에서 PCR product를 형성한 것은 46개였으며, 총 형성된 band의 수는 158개로 나타났다. Band를 형성한 primer와 band를 형성하지 않은 primer간의 GC content를 비교하면 band를 형성한 primer의 경우 GC content는 평균 67.4%이었다. 그러나 band를 형성하지 못한 primer의 경우에는GC함량이 평균58%이었다.

• 한국축산식품학회지
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• 제31권6호
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• pp.851-857
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• 2011

This study was conducted to develop a real time reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) method for the detection of viable Enterobacteriaceae in milk using primers based on the genes of ribosomal proteins S11 and S13 and to determine effects of heating and subsequent treatments on the threshold cycle (Ct) of the real time RT-PCR. Total RNA was isolated from 17 strains of bacteria including 11 strains of Enterobacteriaceae suspended in milk using a modified Tri reagent method. SYBR Green Master Mix was added to the RNA and the mixture was subjected to the real time RT-PCR. The Cts of eleven type strains of the Enterobacteriaceae in milk ($10^7$ cells) in the real time RT-PCR ranged from 21.5 to 24.6. However, the Cts of Pseudomonas fluorescens, Acinetobacter calcoaceticus, and three gram-positive bacteria were more than 40. The real time RT-PCR detected as low as $10^3$ cells in agarose gel electrophoresis. The Cts increased from 22.0 to 34.2 when milk samples contaminated with Escherichia coli ($10^7$ cells/mL) were heated at $65^{\circ}C$ for 30 min. In addition, subsequent incubation at $37^{\circ}C$ for 6 and 24 h increased the Cts further up to 36.2 and 37.2, respectively. Addition of RNase A to the bacterial suspension obtained from the heated milk and subsequent incubation at $37^{\circ}C$ for 1 h increased the Cts to more than 40. The results of this study suggests that pretreatment of bacterial cells heated in milk with RNase A before RNA extraction might enhance the ability to differentiate between viable and dead bacteria using real time RT-PCR.

• KSBB Journal
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• 제24권5호
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• pp.432-438
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• 2009

본 연구는 환경샘플 중 병원균을 진단하기 위한 목적을 가진다. 최소 챔버 칩에서 환경 샘플 중 병원균을 농축하고 mRNA를 증폭하여 효과적이고 간단한 진단방법을 고안하였다. PDMS로 면적 $1.5\;cm{\times}\;1.5\;cm$, 높이 $100\;{\mu}L$의 칩을 제작하여 유리에 부착시켰다. RNase에 의한 진단 오류 또는 실패를 막고자 RNase away 처리를 하고, RNA와 PDMS의 결합을 막기 위해 BSA 처리를 하였다. 수질에 있는 병원균은 매우 적은 농도로 존재하므로 농축의 과정이 필요하다. 농축의 방법에는 여러 가지가 있으나 본 연구에서는 유리 비드를 칩 내에 삽입하고 저농도의 시료를 주입함으로서 고농도로 농축을 하는 방법을 사용하였다. 그러나 부피가 작은 칩 내에서 수행하기에는 내부 압력이 작용하여 문제가 발생하여 $100\;{\mu}m$의 유리 비드를 사용하고 유리비드의 칩 내부 이탈을 방지하기 위하여 댐을 만들어 농축에 가장 적합한 칩의 형태를 잡았다. 시료의 주입속도에 따라 내부 압력이 상승하여 댐의 기능이 상실하여 유리 비드가 이탈하게 되므로 그것을 방지하기 위하여 칩 내에 댐을 강화하여 만들고 내부압력 증가가 방지되는 최적의 댐을 개발하여 시료의 주입 속도 5 mL/min까지 유리 비드의 이탈을 막았다. 유리 비드에서의 RNA 농축은 pH 5에서 효과적이고 pH가 증가할수록 유리 비드와 RNA의 결합이 끊어지는 현상을 보였으므로 시료에 pH 5의 버퍼를 첨가하여 농축을 진행하고 중성의 NASBA 용액을 주입하여 유리비드에서 탈착된 농축된 고농도의 RNA를 증폭하였다. NASBA는 항온 수조에서 온도에 변화 없이 $41^{\circ}C$에서 1시간 30분 동안 진행하며 증폭된 mRNA는 직접 확인하였다. 이 방법은 LOC 기술을 적용하여 저농도의 시료를 효과적으로 측정할 수 있도록 편리한 바이오 칩을 개발함으로써 대용량의 샘플 중 극 저농도의 대장균을 효과적으로 검출할 수 있는 장점을 가지고 있다.

• Plant Resources
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• 제4권3호
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• pp.192-195
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• 2001

Human immunodeficiency virus (HIV), the causative agent of AIDS, still continues to spread rapidly in the world population, especially in Africa and Southeast Asia. At present, two kinds of therapeutic approaches are used for treatment of AIDS. One is to target HIV reverse transcriptase, which is responsible for the viral genome transcription. The other is to inhibit HIV pretense PR, which is essential for the processing of viral proteins. Drug combinations based on these approaches can reduce the blood virus to an undetectable level. However, a small amount of virus may lurk inside the immune cells in a dormant state. Another major obstacle of long-term treatment of the disease is remarkable mutation in HIV. Most of the clinical chemotherapeutic agents have one or more of these problems. High cost and harmful side-effects further reduced the desirability of these drugs. In the course our studies on development of anti-HIV agents from natural products, we investigated various crude drugs for their inhibitory activity against HIV-induced cytopathic effects (CPE) in culture cells, HIV-pretense (PR), HIV-reverse transcriptase (RT) including ribonuclease H (RNase H), and HIV integrase (INT). In the present paper, some inhibitory substances relating to the development of anti-HIV agents are reported.

• 한국균학회지
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• 제20권3호
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• pp.234-239
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• 1992

Virus 이병(罹病) 느타리버섯 (Pleurotus spp.)으로부터 이중나선(二重螺腺) ribo 핵산(核酸 )(ds RNA)을 분리(分離)하였다. Ds RNA 는 8100 base pairs(bp)의 큰 band 와 2170, 2120, 1980 및 1840 bp의 4개 작은 band로 이루어졌다. Ds RNA 분석법(分析法)으로 느타리버섯의 Virus 이병여부(罹病與否)를 조사(調査)한 결과(結果) 균사생장(菌絲生長)이 부진(不振)하고 세균성(細菌性) 갈색(褐色) 부패병(腐敗病) 등(等)에 이병(罹病)되고 이상자실체(異常子實體)를 형성(形成)하는 느타리버섯으로부터 Virus 이병(罹病)을 확인(確因)하였으나 건전(健全)버섯으로부터는 ds RNA를 분리(分離)하지 못하였다. 이 병(病)은 해외(海外)로부터 전래(傳來)한 것으로 보인다. Ds RNA 는 저농도염류액(底濃度鹽類液) (0.1XSSC)에서 RNase A 에 용해(鎔解)되었으며 $85^{\circ}C$ 에서 특성변화(特性變化)가 발생(發生)하였다.

• 한국식품영양학회지
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• 제15권2호
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• pp.104-111
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• 2002

호열균 B. stearotheymophilus으로부터 단백질 고차구조 형성을 촉진하는 내열성 PPIase를 정제하기 위해, 이 균체를 대량으로 배양 집균, 파쇄하여 효소활성을 측정하였다. 효소의 활성측정은 N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(pAN)를 기질로 사용하였다. chymotrypsin은 기질 이성체(cis-trans 형)의 한쪽(trans)만을 특이적으로 분해하는 반응을 이용하여 PPIase 활성을 측정하였다. 호열균 추출시료로 부터 효소활성을 확인한 후, DEAE-sepharose CL-6B, Sephadex G-75로 정제 후, 최종적으로 Superose TM-12 (FPLC) gel-필트레이션으로 분자량 18kDa의 본 효소를 정제하였다. 정제한 효소의 화학적 특징을 조사한 결과 pH 7.5~8.0사이에 안정하였으며, 최적 pH는 8.0으로 나타났다. 그리고 $65^{\circ}C$에 30분간 열처리 후, 효소활성을 측정한 결과 50%이상의 잔존 활성을 갖는 내열성 효소임을 확인하였다. 정제 단백질의 N-말단 아미노산 분석은 Edman 분해법으로 39 아미노산 잔기를 결정하였다. 그리고 PPIase의 재구성(refolding) 반응은, 요소로 변성시킨 기질 RNase 1을 이용하여 이 단백질의 재구성 (refolding) 실험을 조사한 결과, PPIase는 변성 기질 RNase 1의 재구성(refolding)을 촉진하는데 높은 효과를 가지고 있었다. 호열균 유전자 라이브러리로부터 PPIase 유전자 약 3kb을 클로닝하였다. 재조합 플라스미드 cPI-40에서 프라이머(A-1, B-2)를 이용하여 PPIase N-말단을 코드하는 유전자를 PCR법으로 증폭하여, 염기배열을 결정한 결과 증폭된 단편은 165염기로 형성된 55 아미노산 잔기를 코드하는 open reading frame(ORF)가 연속되고 있었다. 그리고 Edman법으로 결정한 PPIase의 39아미노산 잔기가 이 배열내에 완전히 보존되어 있었다. 이 결과로부터 이 ORF는PPIase구조 유전자의 1/3에 해당하는 단편임을 확인하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제30권1호
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• pp.68-72
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• 2002

RNA 함량이 증가되고, 증식속도가 더 빠른 효모 변이주를 선별하기 위해, 모균주 Saccharomyces cerevisiae MTY62 세포에 화학적 돌연변이제인 ethylmethane sulfonate를 처리하여, YPD 배지에서는 잘 자라고 KCl 함유 배지에서는 자라지 않는 변이주들을 선별하였다. 이 변이주들 중 시험관 및 플라스크 배양을 통해 균체농도와 RNA 함량이 모균주 MTY62에 비해 각각 1.5배, 1.3배 증가한 M40-10 변이주를 최종적으로 선별하였다. 변이주 M40-l0을 발효조 회분배양한 결과, 최대비증식속도는 $0.38 h^{-1}$ , RNA 농도는 3210 mg-RNA/1, RNA 함량은 183mg-RNA/g-DCW 값을 보여, 모균주에 비해 각각 23%, 15%, 12%씩 증가하였다. M40-10 변이주를 간헐적 유가배양한 결과, 최대 균체농도는 35.6 g-DCW/1을, 최대 RNA 농도는 5677mg-RNA/l을, RNA함량은 160 mg-RNA/g-DCW을 나타내어 모균주보다 우수하였다. 일정속도의 유가배양에서도 M40-10 변이주의 최대 균체농도는 46.4g-DCW/1, RNA 농도는 6270mg-RNA/1, RNA 함량은 135mg-RNA/g-DCW을 보였다. 이들 유가배양에서 배양 중반기인 20시간 전후에서는 모균주에 비해 변이주의 세포농도는 30%, RNA 농도는 10% 정도 증가되었다. 또한 유가배양 말기까지도 RNA 분해는 거의 일어나지 않아, M40-10 변이주는 산성 RNase 활성이 크게 감소한 변이주임을 알 수 있었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제23권6호
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• pp.878-884
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• 2013

Salmonella is a major foodborne pathogen that causes a variety of human diseases. Development of ligands directly and specifically binding to the Salmonella will be crucial for the rapid detection of, and thus for efficient protection from, the virulent bacteria. In this study, we identified a RNA aptamer-based ligand that can specifically recognize Salmonella Typhimurium through SELEX technology. To this end, we isolated and characterized an RNase-resistant RNA aptamer that bound to the OmpC protein of Salmonella Typhimurium with high specificity and affinity ($K_d$ ~ 20 nM). Of note, the selected aptamer was found to specifically bind to Salmonella Typhimurium, but neither to Gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus) nor to other Gram-negative bacteria (Escherichia coli O157:H7). This was evinced by aptamer-immobilized ELISA and aptamer-linked precipitation experiments. This Salmonella species-specific aptamer could be useful as a diagnostic ligand against pathogen-caused foodborne sickness.